浮游植物葉綠素a含量測定方法的比較及優化

張 紅, 呂 富, 呂林蘭, 黃金田

(鹽城工學院 化學與生物工程學院, 江蘇 鹽城 224003)

浮游植物的種群生物量是水生生態系統研究的一個重要指標, 葉綠素 a存在于所有浮游植物體內,占細胞干質量的 1%～2%, 通常可以用來快速估算種群生物量和浮游植物的增殖能力, 因此浮游植物葉綠素 a含量的測定成為浮游植物生物量的重要指標已被廣泛應用[1-4]。葉綠素a常用作水體初級生產力的衡量指標, 在水域環境生物學研究及漁業初級生產力調查中被廣泛應用。

目前, 浮游植物葉綠素 a的測定方法主要有高效液相色譜法、熒光光度計法和分光光度計法。分光光度計法因操作簡單、準確可靠等優點成為了目前普遍使用的測定浮游植物葉綠素a的方法[5-6]。目前國際上仍廣泛使用丙酮作為萃取溶劑的單色法測定浮游植物葉綠素 a的含量, 但從萃取效果和安全性等考慮, 已逐漸采用乙醇作溶劑進行萃取。目前已有一些關于葉綠素 a測定方法的比較, 熱乙醇法測定誤差的探討及方法優化等的報道, 但直接以天然養殖池塘的水樣作為分析對象, 考慮熱乙醇法的各個因素對提取葉綠素 a的影響未見報道[7-9]。因此, 本研究比較了熱乙醇法和丙酮法, 并利用方差分析優化熱乙醇法提取浮游植物葉綠素 a方法中各影響因素的最佳條件, 以期得到更為精確、有效、簡便的測定方法,為快速估算養殖水體種群生物量提供基本依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水樣取自射陽鹽場達陽養殖區 D13池塘, 該塘約13 ha(200畝), 采用鯽魚為主, 鰱魚為輔的混養模式, 以五點取樣法, 于水面以下0.5～1.0 m采樣。

1.2 試驗方法

1.2.1 水樣的處理和保存

根據金相燦等[1]的“湖泊富營養化調查規劃”和章宗涉等[10]的“淡水浮游生物研究方法”所述方法, 取300 mL水樣經微孔濾膜過濾后, 將帶樣品的濾膜剪碎放入10 mL離心管中于冰箱冷凍室–20℃保存。

1.2.2 熱乙醇萃取分光光度法(乙醇法)步驟

1.2.3 丙酮萃取分光光度法(丙酮法)步驟

根據金相燦等[1]和章宗涉等[10]所述方法, 取帶樣濾膜剪碎后在研缽中加適量 90%丙酮研磨至足夠細, 移入試管中于暗處靜置萃取 4～10 h后, 離心得清液定容, UV-2100型分光光度計測定方法同上, 葉綠 素 a 計 算 公 式 為 : Chla丙酮=27.3×[(E665–E750)–(A665–A750)]×V丙酮/V水樣

1.3 試驗設計

1.3.1 乙醇法和丙酮法測定比較

在同一水域采 5個平行水樣, 同時用丙酮法和乙醇法測定葉綠素 a含量, 另在 5個不同水域采樣,也用兩種方法測定, 用方差分析F檢驗比較結果。

1.3.2 乙醇-超聲法測定條件優化

在乙醇-超聲法處理時, 試驗設置冷凍時間為 0和24 h, 各重復5次。試驗設置萃取時間依次為2、4、6、8、10 h; 超聲波破碎時間依次為0、1、2、3、4 min; 水浴溫度依次為 50、60、70、80、90 ℃, 以上各重復3次。

2 結果與分析

2.1 乙醇法與丙酮法測定結果的統計比較

據表1結果, 經方差分析F檢驗,F=20.046大于11.26(F0.01(1.8))。說明兩種方法的測定結果具極顯著差異, 乙醇法測定結果顯著高于丙酮法結果, 說明乙醇法對浮游植物的葉綠素 a萃取較完全。乙醇法測定結果的方差和標準誤差都低于丙酮法測定結果,也說明乙醇法帶來的操作誤差較小。

根據在不同水域樣品的測定結果, 計算相關系數R2=0.9990, 說明兩方法存在顯著相關關系, 回歸方程為: Chla丙酮=1.0932Chla乙醇–11.677(如圖 1)。

2.2 乙醇-超聲法是否凍融測定結果的比較

結果表明, 同一水域的樣品運用凍融法測定結果極顯著高于非凍融法(表2)。經SPSS方差分析, 結果為S冷凍(0.824)>S不冷凍(0.739), 樣品經凍融處理后葉綠素a提取率顯著高于非凍融法。

圖1 測定葉綠素a含量的乙醇法和丙酮法結果相關關系Fig. 1 The correlation between hot-ethanol and cool-acetone method for measuring chlorophyll a

表1 乙醇法和丙酮法測定結果比較Tab. 1 The comparasion between the ethanol and acetone method

表2 凍融對葉綠素a提取的影響Tab 2 Effect of extraction freezing on extraction of chlorophyll a

2.3 乙醇-超聲法萃取時間的比較

如圖2所示, 葉綠素a含量隨萃取時間的增加而增加。萃取時間為10 h時葉綠素a含量最高, 但與6 h和8 h萃取時間相比, 葉綠素a含量沒有顯著差異; 萃取時間為4 h和2 h時, 葉綠素a含量均顯著低于6 h。故考慮萃取6 h為宜。

2.4 乙醇-超聲法超聲波破碎時間的比較

隨超聲波破碎時間的延長, 葉綠素 a含量逐漸增高(圖 3)。超聲波破碎時間為 4 min時達最高值55.05 μg/L, 與破碎時間3 min相比, 不存在極顯著差異, 但極顯著高于破碎時間2 min及以下結果。因此, 考慮超聲波破碎3 min為宜。

圖2 萃取時間對葉綠素a提取的影響Fig. 2 Effects of extraction time on extraction of chlorophyll a

圖3 超聲波時間對葉綠素a提取的影響Fig. 3 Effects of ultrasonic time on extraction of chlorophyll a

2.5 乙醇-超聲法熱提取不同水浴溫度的比較

由圖 4可知, 水浴溫度從 50℃增加到 80℃時,葉綠素 a含量也逐步上升, 在水浴溫度為 80℃時葉綠素 a含量達最高值為 73.64 μg/L, 而水浴溫度90℃時卻突然下降, 且極顯著低于 80℃時的數值。故考慮最佳水浴溫度為80℃。

圖4 水浴溫度對葉綠素a提取的影響Fig. 4 Effects of water bath temperature on extraction of chlorophyll a

3 結論與討論

3.1 不同萃取方法的葉綠素a的萃取效率

本實驗對養殖水體的同一水域或不同水域的測定結果均顯示, 乙醇-超聲波法的萃取效率顯著高于丙酮法。這與楊彩根等[3]的實驗結果類似, 認為乙醇-超聲波法明顯優于丙酮法。從試驗的易操作性分析,丙酮法樣品磨碎費工費時, 手工研磨細胞破碎不完全, 不利于大批量樣品的測定。同時, 國內生產的醋酸纖維微孔濾膜在丙酮中完全溶解, 對分光光度計吸收值測定有影響, 也就影響了葉綠素 a質量濃度的測定結果[11-12]。而乙醇法先利用冷處理破碎細胞,經熱乙醇萃取后再利用超聲波進一步粉碎細胞處理,葉綠素 a的萃取較完全。建議在養殖水體監測及水環境監測葉綠素a含量領域采用乙醇-超聲波法。

3.2 乙醇-超聲法測定條件的優化

本試驗表明, 運用乙醇-超聲法測定浮游植物葉綠素a含量時, 應將帶樣品的濾膜–20℃冰凍24 h以上, 加適量 80℃熱乙醇在 80℃水浴中解凍, 經超聲波破碎機超聲振蕩處理3 min后, 室溫黑暗條件下萃取6 h, 再離心定容測定。這與趙玉華[13]試驗結果相似, 合適的萃取時間為6～8 h。梁興飛等[9]由正交優化試驗得出最佳條件為: 萃取溫度 80℃, 萃取時間2 h, 乙醇濃度90%, 超聲波(40W, 20kHz)破碎10 min,并且, 隨著超聲波破碎時間過長, 會造成提取液局部溫度上升, 葉綠素開始降解, 進而影響葉綠素含量的測定。

水浴溫度為 80℃, 這與絕大多數研究結果相同,當水浴溫度達90℃時, 葉綠素a的值明顯下降, 表明葉綠素因溫度過高而被破壞[14]。另外乙醇的沸點是81℃, 當水浴溫度高于 80℃時會使得乙醇部分蒸餾而出, 降低了乙醇的濃度, 影響了熱乙醇的萃取[15]。

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