蛋白質營養對工業化養殖大菱鲆生長、消化和免疫的效應

高婷婷, 李 勇, 張家國, 柳 陽, 周邦維

(1. 上海海洋大學 水產與生命科學學院, 上海 201306; 2. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071)

蛋白質是魚類需要量較大、維持其生命活動穩態并進行正常生產的物質基礎, 也是合成各種酶類使免疫反應成功進行和患病后恢復健康的重要條件,因而屬于對魚類生長、繁育、代謝、健康等至關重要的一類營養物質, 這一特點在肉食性魚類中尤為突出。

大量研究證實, 日糧魚粉蛋白質含量的增加能有效提高魚類消化功能和飼料利用率, 促進其快速生長[1-5]。在蛋白質營養對魚類免疫功能發揮的影響方面, 前人研究較少, 就現有資料表明, 在一定范圍內適度增加日糧蛋白質含量有利于降低試驗魚死亡率, 提高其血液溶菌酶、超氧化物歧化酶活力[6]及c-反應蛋白和補體含量[7-8], 進而提高試驗魚的免疫機能。但是, 日糧蛋白質水平提高所帶來的免疫增強效應, 將會隨著蛋白質含量的進一步增加而逐漸表現得不明顯, 甚至表現出一定的免疫抑制[6-9]。近年來,隨著營養與免疫的重要性越來越受到關注, 蛋白質作為一種能夠影響魚類免疫系統發育、免疫功能發揮及魚類對應激和疾病抵抗力的間接防疫手段, 值得深入研究。

本研究在工業化封閉循環水系統中進行, 此種養殖模式以其高效、環保、低碳、可持續等優勢,在國內外迅速發展, 將成為現代水產養殖的主要模式。而過量營養、殘餌和排泄物是該系統水體污染的主要來源, 亦是導致魚病爆發的重要隱患[10-12],是循環水養殖監控過程中的關鍵因素。工業化養殖條件下日糧蛋白質營養對養殖魚類免疫機能的研究報道甚少, 本課題組前期在對蛋白質生態營養需要量的研究中發現, 日糧蛋白質水平對循環水養殖半滑舌鰨(Cynoglossus Semilaevis Günther)免疫力和死淘率存在一些規律性影響[13]。

因此, 在課題組前期研究的[5,13,14,36-59]基礎上,本試驗以中國海水魚養殖規模較大的大菱鲆(Scophthatmus maximusL.)為對象, 通過試驗日糧蛋白質水平差異對生長、消化與免疫機能的影響特征,進一步查明循環水養殖條件下蛋白質營養與動物免疫和健康的關系及規律, 為工業化海水魚養殖的生態營養調控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計、管理和飼料

試驗魚由山東東方海洋股份有限公司提供, 試驗開始前禁食 24 h, 選擇大小均勻(145.08 g±0.56 g)、健康、活力好的大菱鲆幼魚, 隨機分配于 12個85 cm ×55 cm ×45 cm 養殖箱(4 個試驗處理組, 每組3個重復), 每箱12尾。4種日糧蛋白質含量水平分別為: 41%、46%、50%、55%, 分別以 I、II、III、IV組表示。試驗在室內封閉循環水系統中進行, 日換水量占總水量的10%, 每天循環45次, 馴養10 d,正式試驗 64 d, 試驗水溫保持 15.5℃±0.5℃, 溶氧10～11 mg/L, 鹽度 22±1, 水深 40 cm±2 cm, 光周期 L : D=11 : 13, 試驗飼料原料混勻、超微粉碎后,經大型雙螺桿擠壓膨化機制成均勻的直徑為 0.5 cm的沉性膨化顆粒飼料, 試驗飼料配方見表1。每天投喂2次(7 : 00, 17 : 00)至飽食, 每次飼喂半小時后,將殘餌虹吸記錄剩余飼料顆粒數, 乘以平均粒重從投飼量中扣除。發現死魚及時撈出稱質量, 記錄。試驗結束前, 饑餓24 h, 次日空腹稱質量。

1.2 指標測定方法

1.2.1 生長性能

表1 大菱鲆試驗飼料組成及主要營養成分含量Tab. 1 Ingredients and concentrations of nutrients of experimental diets for turbot

1.2.2 消化酶活力

1.2.2.1 樣品采集

生長試驗結束前, 饑餓 24 h, 每個重復取健康試驗魚6條, 每處理共18條, 將所選魚置冰盤脊髓處死,解剖, 分別取小塊胃腸和肝胰臟組織, 清除內容物, 剔出脂肪, 至于凍存管中–20℃冰箱保存備用。

1.2.2.2 樣品前處理

將每個重復中6條魚的組織分別兩兩混合成為3組混合樣品, 即每個處理9組混合樣, 準確稱量后按質量體積比加入 4倍(胃腸組織)、9倍(肝胰臟組織)生理鹽水制成 20%(胃腸組織)、10%(肝胰臟組織)的組織勻漿, 2 500 r/mim離心10 min, 取上清液4℃冷藏, 進行酶液蛋白含量、蛋白酶活力、淀粉酶活力、脂肪酶活力的檢測, 24 h內測定結束。

1.2.2.3 測定方法及原理

胃蛋白酶(胃腸組織)測定根據該酶可以水解底物最終形成一種藍色的化合物, 通過比色即可測定其活力的原理采用化學比濁法測定; 胰蛋白酶(肝胰臟組織)測定是根據該酶水解底物后使其在 253 nm處吸光值升高, 通過吸光度變化可以計算其活力的原理采用紫外比色法測定; 淀粉酶測定是根據淀粉水解生成葡萄糖、麥芽糖及糊精, 在底物濃度已知并且過量的情況下, 加入碘液與未水解的淀粉結合生成藍色復合物, 根據藍色的深淺可推算出水解的淀粉量, 從而計算出淀粉酶的活力, 采用碘–淀粉比色法; 脂肪酶根據其水解底物使濁度降低, 減低的速率與其活力有關, 采用化學比濁法測定。

1.2.3 免疫機能

1.2.3.1 樣品采集

生長試驗結束前, 饑餓 24 h, 每個重復取健康試驗魚6條, 每處理共18條, 將所選魚置冰盤脊髓處死, 尾靜脈取血, 肝素抗凝, 至于5 mL離心管中;解剖, 分別取小塊肝臟、脾臟、頭腎和腮絲組織, 純水洗凈后至于凍存管中–20℃冰箱保存備用。

1.2.3.2 樣品前處理

血液樣品至于 4℃過夜, 自然析出血清后, 4℃下 3 000 r/min離心 10 min, 將血清轉移至新管中,–0℃保存待測; 將每個重復中6條魚的肝、脾、頭腎和腮絲組織分別兩兩混合成為 3組混合樣品, 即每個處理9組混合樣, 準確稱量后按質量體積比加入9倍生理鹽水制成10%的組織勻漿, 2 500 r/min離心10min, 取上清液進行測定。

1.2.3.3 測定方法及原理

溶菌酶(LYZ)活力: 在一定濃度的混濁菌液中,由于溶菌酶能水解細菌細胞壁上肽聚糖使細菌裂解而濃度降低, 透光度增強, 依據透光度變化來推測溶菌酶的活力。

超氧化物歧化酶(SOD)活力: 通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產生超氧陰離子自由基(O2-),后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽, 在顯色劑的作用下呈現紫紅色, 用可見光分光光度計測其吸光度。血清中SOD酶活力單位定義為每mL血清中SOD抑制率達到50%所對應的SOD量為1個酶活力單位。

丙二醛(MDA)含量: 采用 TBA法, 即過氧化脂質降解產物中的丙二醛可與硫代巴比妥酸縮合, 形成紅色產物, 在532 nm處有最大吸收峰, 通過抑制濃度的標準樣與空白樣在此處的 OD值計算出未知樣品中MDA含量。

酸性磷酸酶(ACP)活力: 堿性磷酸酶分解磷酸苯二鈉, 產生游離酚和磷酸, 酚在堿性溶液中與 4-氨基安替吡啉作用經鐵氰化鉀氧化生成紅色醌衍生物, 根據紅色深淺可以測定酶活力的高低。

補體C3含量: 樣品中C3抗原與試劑中相應的抗體在溶液中相遇, 立即形成抗原-抗體復合物, 并形成一定濁度。該濁度的高低在一定量抗體存在時與抗原的含量成正比。根據以標準品制備的標準曲線, 計算未知樣品中C3含量。

1.3 統計分析

實驗數據(Mean±S.E.M.)用 SPSS 16統計軟件進行單因素方差分析, 當差異顯著時(P<0.05), 進行Tukey多重比較。

2 試驗結果

2.1 生長性能

由表 2所示, 試驗魚增質量率隨著日糧蛋白質水平升高而提高, 其中III、IV兩組增質量率分別極顯著高于 I組 61.19%和 65.75%(P<0.01), 分別顯著高于 II組18.46%和21.81%(P< 0.05), III、IV兩組間沒有顯著差異; 餌料系數則呈相反規律, III、IV兩組分別極顯著低于I組21.15%和27.73%(P<0.01), II、III、IV 3組間沒有顯著差異; 蛋白質效率各組沒有顯著差異。

表2 不同日糧蛋白質水平組大菱鲆生長性能Tab. 2 Effects of different feed on growth of turbots

2.2 消化酶活力

2.2.1 胃腸消化酶

如表 3所示, 日糧蛋白質水平對試驗魚胃腸淀粉酶活力沒有顯著影響, 但對胃蛋白酶和脂肪酶活力影響(極)顯著。隨日糧蛋白水平升高胃蛋白酶活力則逐漸升高, 其中 IV 組分別極顯著高于其他各組15.27%、17.90%和31.98%(P< 0.01), II、III兩組無顯著差異, III組顯著高于I組14.49%; 而胃腸脂肪酶活力逐漸降低, 其中 I 組活力顯著高于 III組36.05%(P<0.05), 極顯著高于IV組61.39%(P< 0.01),II、III兩組間沒有顯著差異。

2.2.2 肝胰臟消化酶

如表 4所示, 試驗魚肝胰臟淀粉酶和脂肪酶活力受日糧蛋白水平影響不顯著, 胰蛋白酶活力有顯著差異。其中, IV組試驗魚肝胰臟胰蛋白酶活力最高,顯著高于III 組9.79%(P< 0.05), 分別極顯著高于I、II組36.53%和26.35%(P< 0.01); I、II兩組差異不顯著。

表3 不同日糧蛋白質水平組大菱鲆胃腸消化酶活力Tab. 3 Effects of different feed on the digestive enzyme activity in stomach and intestine of turbots

表4 不同日糧蛋白質水平組大菱鲆肝胰臟消化酶活力Tab. 4 Effects of different feed on the digestive enzyme activity in hepatopancreas of turbots

2.3 免疫機能

2.3.1 組織溶菌酶活力

如表 5所示, 一定程度上提高日糧蛋白質含量,試驗魚主要免疫器官組織溶菌酶活力逐漸增強, 但是日糧蛋白水平的繼續增加并沒有上述組織溶菌酶活力有進一步的提高, 反而有不同程度的下降。隨日糧蛋白含量的提高, 各組試驗魚主要免疫器官組織溶菌酶活力呈先上升后緩降的趨勢, III組活性最高,其中肝臟溶菌酶活力分別極顯著高于 I 組80.07%(P<0.01), 顯著高于II組43.56%(P<0.05); 頭腎溶菌酶活力極顯著高于 I 、II兩組 67.78%和35.76%(P< 0.01); III、IV兩組差異不顯著。脾臟、腮絲溶菌酶活力雖亦表現出上述變化規律, 但各處理組之間差異不顯著。各組織溶菌酶活力變化趨勢見圖 1。

如表 6所示, 各組試驗魚血清 SOD活力及 C3補體含量隨日糧蛋白含量的增加而提高但各處理間差異不顯著, 血清 MDA含量則呈相反規律, 血清ACP活力及溶菌酶活力隨蛋白水平的提高先升高后稍降。其中 III組血清溶菌酶活力極顯著高于 I 組31.92%(P< 0.01), 顯著高于 II組 18.72%(P< 0.05),也高于IV組2.66%, 但統計差異不顯著。血清MDA隨蛋白水平的提高顯著降低, IV組分別極顯著低于I、II、III組31.61%、14.32%及13.26%。

表5 不同日糧蛋白質水平組大菱鲆不同組織溶菌酶活力Tab. 5 Effects of different feed on the tissue lysozyme activity of turbots

表6 不同日糧蛋白質水平組大菱鲆血清免疫相關酶活力Tab. 6 Effects of different feed on the seroenzyme activity of turbots

圖1 不同日糧蛋白質水平組大菱鲆主要免疫組織溶菌酶活力變化趨勢Fig. 1 Effects of different feed on the tissue lysozyme activity of turbots

3 討論

日糧蛋白質含量直接影響魚類生長, 增加蛋白含量對生長性能的促進作用已經證實[15-18]。也有研究表明日糧適中蛋白質含量比過低或過高水平更有利于促進魚的生長和提高飼料利用率[19-20]。本課題組前期對海水鰈形目(Pleuronectiformes)魚類的試驗研究發現, 試驗魚增質量率隨日糧蛋白質含量增加呈先升高后趨緩的趨勢[16,21-22]。在本試驗研究中, 隨日糧蛋白質含量由 41%增至 50%, 試驗魚的增質量率和飼料系數均得到顯著的改善, 而 55%組較 50%組試驗魚在生長性能指標上并沒有顯著變化, 此結果與本課題組前期試驗研究結果規律一致。由此可見, 過高日糧蛋白質含量會對工業化養殖魚類生長造成負面影響, 當日糧蛋白質小幅過量時, 雖沒有負面影響, 但亦未有明顯的促生長效果。

日糧蛋白質水平與魚類消化酶活力存在一定關系[21,26-29,22-25]。本研究中, 大菱鲆胃腸及肝胰臟蛋白酶活力均隨日糧蛋白含量的增加呈先提高后緩降趨勢, 與生長性能變化規律基本符合, 即 55%組比50%組魚的增質量并沒有顯著提高, 對應的蛋白質消化酶活力還稍有降低[26-30]。研究表明消化酶活力不僅取決于酶活性中心的性質, 且與底物和介質等有關。因此, 產生上述結果的原因可能是負反饋調節作用, 即蛋白酶活力在一定范圍內受底物量增加誘導而提高, 當消化蛋白質超過魚體需要或自身吸收代謝能力時, 通過負反饋調節使蛋白酶活力降低來減少代謝負擔。此外, 試魚胃腸較肝胰臟表現出較高的蛋白酶活力, 這一特點在一些魚類消化酶研究中也被發現[31-32], 表明胃腸道是大菱鲆消化蛋白質的主要場所, 肝胰臟起輔助消化作用。脂肪酶方面, 正如前人研究報道的[24-25], 其活力隨蛋白質含量的增加而降低, 即日糧蛋白質供應不足時, 魚類通過提高脂肪酶活力、增加脂類氧化供能來減少蛋白質作為能源消耗。淀粉酶活力低, 且對日糧蛋白質含量變化不敏感, 這與肉食性大菱鲆對碳水化合物消化能力低下有關[31,33-36]。

魚類免疫機能發揮主要依靠非特異性免疫途徑實現, 蛋白質是動物合成各種酶類和抗體蛋白所必需的原料,與機體免疫力密切相關[37]。前人對多種養殖魚類的研究表明, 魚類非特異性免疫機能提高并不需要日糧蛋白質含量很高[38-40]。王美琴等[13]在研究工業化封閉循環水養殖半滑舌鰨的蛋白質營養需求時發現, 日糧中等蛋白質水平, 不僅為其生態需要量所在范圍, 而且是最低死淘率所在范圍, 顯著提高血清溶菌酶與超氧化物歧化酶的活力, 也使C3、C4補體含量明顯增加。

本試驗在課題組前期研究工作基礎上, 測析了更多能夠反映養殖魚類免疫機能的指標, 旨在更全面地評價日糧蛋白質營養對試魚免疫機能的影響,其結果不僅與前期研究基本一致, 而且新測指標顯現出更明顯的規律或特征。首先, 本試驗低蛋白組試魚各項免疫指標較其他組均呈明顯劣勢, 其中血清MDA增加量極顯著, 表明當日糧蛋白缺乏時, 會大大增加脂類被自由基氧化產生 MDA的機率。MDA具有細胞毒性, 其大量產生無疑對魚類健康威脅嚴重, 此點在本試驗低蛋白組較高死淘率上得以明顯體現。其次, 在本試驗魚的腮絲、肝臟、脾臟、頭腎等組織及血清中均檢測到溶菌酶, 其中血清活力最高, 腮絲次之, 脾臟最低, 表明腮作為魚類阻止有害菌入侵的第一道屏障, 溶菌酶在其中發揮了積極而重要的作用, 而當有害菌侵入體內后, 血液中高活力的溶菌酶在對抗或殺傷外來有害菌方面更加具有實際意義[41-42]。再者, 本研究結果顯示, 溶菌酶與其他測定的非特異性免疫因子相比, 其活力變化對日糧蛋白含量更加敏感, 且呈現一定規律, 即隨日糧蛋白水平提高其活力先增強后略降, 具體表現在55%蛋白組試魚各組織及血清溶菌酶活性比 50%組有所降低, 但差異不顯著。日糧高蛋白水平呈現一定程度免疫抑制的可能原因, 作者分析有兩點: (1)高蛋白攝入增加了魚體代謝負擔, 甚至引起代謝紊亂,從而影響其免疫機能的正常發揮[43]; (2)高蛋白日糧顯著增加魚類氮排泄和飼料氮溶失, 加劇水質污染,長期氨氮脅迫導致魚類免疫能力下降[14,21,23-24,36-42,44]。因此, 飼料中適當含量的優質蛋白能明顯提高魚類免疫力, 過低或過高都會降低機體的免疫與抗病能力。

上述結果證明日糧中高蛋白水平有利于促進工業化養殖比目魚快速生長, 中蛋白水平更有利于其免疫機能的發揮。

4 小結

本試驗在工業化封閉循環水養殖系統中進行,通過日糧蛋白質含量對大菱鲆生長、消化與免疫力影響特征和規律的探尋, 獲得以下結論:

(1)在一定范圍內提高日糧蛋白質含量, 能夠顯著改善魚類的生長性能、降低飼料系數, 但繼續增加蛋白質含量并未帶來進一步促進效果, 且成活率有所降低。

(2)大菱鲆胃腸及肝胰臟蛋白酶活力隨日糧蛋白水平提高而增加, 脂肪酶活力變化則相反, 淀粉酶活力對日糧蛋白含量變化不敏感。

(3)大菱鲆主要組織和血清溶菌酶等免疫指標隨日糧蛋白水平升高, 從 41%到 50%, 呈逐漸增強趨勢, 當超過 50%達到 55%時, 表現一定程度的免疫抑制。

試驗結果表明: 日糧中、高蛋白質含量顯著促進大菱鲆幼魚的生長性能和蛋白質消化酶活力, 而中等蛋白水平更加有利于幼魚重要免疫機能的發揮和成活率的提高。因此日糧中等蛋白質含量更適宜于工業化循環水養殖大菱鲆幼魚的蛋白質營養和健康生長。

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