釀酒酵母的原生質體誘變育種

楊 鑫，胡家俊，方尚玲

湖北工業大學工程技術學院，湖北武漢 430068

酵母菌的菌落與細菌有相像的特征，但酵母菌的菌落小而薄，酵母菌的菌落質地均勻，表面平整，粘稠，酵母菌的各個部位的顏色都很平均。酵母菌發酵所需的條件就是其生長發育和繁殖所需的條件，因為酒精發酵只有在酵母菌出芽繁殖的條件下才能進行，而當發酵停止得時候，酵母菌就會停止生長并死亡。

1 試驗材料

1.1 樣品

釀酒酵母：實驗室冷凍保藏菌株。

1.2 培養基

液體YPD培養基；固體YPD培養基；TTC上層培養基；TIC下層培養基；發酵培養基；高滲再生完全培養基；滲透壓穩定劑；蝸牛酶酶液；脫壁預處理劑

2 方法

2.1 酵母菌原生質體形成與再生條件研究

2.1.1 酵母菌原生質體制備[1]

在YPD培養基斜面上將菌株活化并分別接種于三角瓶中，30℃振蕩培養至對數生長前期。將上述培養液3500r/min離心10min。為了盡可能的避免含有雜質，將使用無菌水沖洗離心。將親本細胞懸浮脫壁預處理溶液中，振蕩，離心收集菌體。將菌體懸浮于3mL的蝸牛酶液中，30℃振蕩培養。對其原生質形態進行跟蹤觀察，當形成率達90%以上時，停止反應，收集原生質體細胞，對其進行離心和沖洗以后將細胞懸浮于滲透壓穩定劑中。

2.1.2 酵母菌原生質體形成與再生條件正交試驗

從表1可以知道酵母菌原生質體形成與再生的最佳條件是通過酶解時間，蝸牛酶濃度，選取脫壁預處理時間這三個因素的三水平正交試驗得來的。

表1 正交試驗因素水平表

2.1.3 酵母菌原生質體形成率與再生率[2]的計算

1）總菌落數；

2）未形成原生質體的菌落數；

3）酶處理后未形成原生質體的菌落數和原生質體再生的菌落數之和：

原生質體形成率（%）=（A-B）/A×100%原生質體再生率（%）=（C-B）/（A-B）×100%

2.2 原生質體紫外誘變育種

2.2.1 酵母菌原生質體紫外誘變株[3]的篩選

取原生質體菌懸液于無菌平皿中，對原生質體細胞進行紫外誘變，將照射后的菌液直接涂布于高滲再生平板和固體YPD平板，置于30℃避光恢復培養。然后將菌落分別接種于斜面平板。

1）初篩（TTC法）

在一定培養基上培養的酵母菌落上與TTC顯色劑會呈現不同的色差反應，當顏色為白色時，可能為野生菌落，當顏色為深紅時，可能是產量高的菌落，當為粉紅時可能產量要弱些。在TTC下層培養基中接入誘變后的菌株，培養24h，長出菌落，然后倒入TTC上層培養基，30℃下保溫（陰暗處）2h～3h。比較各菌株之間的產酒精能力。

2）復篩

將含有發酵培養基的三角瓶中接入初篩時使用TTC法篩出的的優良菌株并按10%的比例接入酵母菌株，于30℃下靜止發酵。每隔12h測一次二氧化碳失重，72h后可以認為發酵結束，發酵結束后測定發酵醪液酒精濃度、殘糖。

2.2.2 各參數的測定方法

1）殘還原糖量[4]：DNS法；2）發酵醪液酒精濃度[5]：蒸餾法；3）二氧化碳失重的測定：直接稱重法。

3 結果與討論

3.1 酵母菌原生質體形成與再生條件研究

表2 酵母菌原生質體形成與再生正交試驗結果

酵母菌原生質體形成與再生正交試驗結果：

由表2可知，在脫壁預處理20min，然后1%的蝸牛酶酶解0.5h的條件下，得出原生質體形成率為和再生率分別為89.7%和19.3%。

3.2 誘變株的篩選

為保證得到性狀優良的突變菌株，本試驗采用了紫外誘變方法對酵母菌株進行原生質體誘變。最終從再生平板中共得到20株誘變株。經過初篩（TTC法）得到5株呈現深紅色的酵母菌落。再將這5株菌株經過復篩得到各個菌株的發酵特性。

表3 誘變株的篩選

由表3可知，相對于出發菌株W酒精產量有所提高的誘變株有3株，占所有突變株的比例為15%。其中突變株W9產酒精量最高，為6.0%，相對于出發菌株W產酒精量提高了22.95%。殘還原糖含量為6.08mg/mL，相對于出發菌株W的6.35mg/mL，相差不大。負突變株W10產酒精量最低，僅為4.12%。

4 結論

1）通過對原生質體形成與再生正交試驗而得到最佳條件如下：在先脫壁預處理20min，然后1%的蝸牛酶酶解30min的條件下，得出原生質體形成率為和再生率分別為89.7%和19.3%；

2）通過初篩和復篩，獲得5株在發酵性能上優越的菌株，初篩中的定性篩選是一個高通量的分析，明確刪除不符合要求的發酵能力弱的菌株。復篩是一個定量分析，可以將高產酒精的菌株給篩出。本次試驗在篩選的初篩中加入了TTC顯色劑，因此在初篩的時候刪去發酵能力弱的菌株，減少了復篩的使用率，說明TTC對于篩選高產酒精酵母菌也很有用；

3）采用原生質體紫外誘變方法，選育得到一株遺傳性狀穩定的突變株W9，發酵72h后，其成熟醪酒精體積分數為6.0%，殘還原糖含量為6.08mg/mL，對比出發菌株W，W9產酒精量提高22.95%。

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