miR-155反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染對(duì)人大腸癌Lovo細(xì)胞侵襲的影響

毛鎮(zhèn)偉 朱靈 范鈺

miR-155反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染對(duì)人大腸癌Lovo細(xì)胞侵襲的影響

毛鎮(zhèn)偉 朱靈 范鈺

目的探討miR-155對(duì)人大腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響。方法 大腸癌Lovo細(xì)胞分為3組:脂質(zhì)體介導(dǎo)反義miR-155(AS-miR-155)組、無(wú)義寡脫氧核苷酸(ODN)組和對(duì)照組。測(cè)定熒光素酶活性驗(yàn)證3組細(xì)胞中miR-155的表達(dá)，采用Matrigel基質(zhì)生長(zhǎng)試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，以Transwell方法檢測(cè)細(xì)胞的侵襲力，結(jié)果 與對(duì)照組和無(wú)義ODN組比較，轉(zhuǎn)染AS-miR-155組Lovo細(xì)胞miR-2l表達(dá)水平降低;Matrigel基質(zhì)生長(zhǎng)試驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染AS-miR-155組Lovo細(xì)胞體外培養(yǎng)克隆平均直徑較小，Transwell細(xì)胞侵襲試驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染AS-miR-155組穿膜細(xì)胞數(shù)較少。結(jié)論miR-2l高表達(dá)可促進(jìn)Lovo大腸癌細(xì)胞侵襲生長(zhǎng)，提示miR-155可以作為基因治療大腸癌的候選靶點(diǎn)。

大腸癌;miR-155;侵襲

許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，microRNAs的異常表達(dá)與多種人類癌癥的發(fā)生密切相關(guān)［1］。研究發(fā)現(xiàn)miR-155在免疫、腫瘤等疾病生理或病理過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用［2，3］。最近，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miR-155在乳腺癌、大腸癌等多種實(shí)體瘤組織或細(xì)胞中高表達(dá)［4，5］，但目前尚不清楚miR-155在大腸癌細(xì)胞侵襲中的作用;本課題組采用寡核苷酸敲低miR-155的表達(dá)，觀察了對(duì)人大腸癌Lovo細(xì)胞生長(zhǎng)侵襲的影響。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 反義寡脫氧核苷酸(antisense oligodeoxyribonucleotides，AS)轉(zhuǎn)染 大腸癌Lovo細(xì)胞在DMEM完全培養(yǎng)液中37℃，5%CO2常規(guī)條件下培養(yǎng)。根據(jù)文獻(xiàn)［6］方法設(shè)計(jì)合成寡脫氧核苷酸序列，轉(zhuǎn)染按照試劑說(shuō)明書操作，空白對(duì)照組加入等體積PBS。

1.2 熒光素酶活性檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Lovo細(xì)胞消化接種于96孔板，4×103個(gè)細(xì)胞/孔;培養(yǎng)12 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組和處理，方法同上。轉(zhuǎn)染24 h后，棄培養(yǎng)基，使用細(xì)胞裂解緩沖液充分裂解細(xì)胞20 min，加入發(fā)光底物20 μL，孵育10 min后使用ELX800酶標(biāo)儀測(cè)定熒光素酶活性。

1.3 Matrige基質(zhì)生長(zhǎng)試驗(yàn) 具體步驟參照文獻(xiàn)［7］方法進(jìn)行。連續(xù)觀察15 d，應(yīng)用相差倒置顯微鏡記錄結(jié)果。

1.4 Transwell細(xì)胞體外侵襲試驗(yàn) 該試驗(yàn)在Transwell板上進(jìn)行，具體步驟參照文獻(xiàn)［7］方法，于倒置顯微鏡觀察穿過(guò)膜細(xì)胞數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 miR-155表達(dá)水平 結(jié)果顯示:對(duì)照組、無(wú)義ODN和AS-miR-155組Lovo細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而兩兩比較顯示轉(zhuǎn)染AS-miR-155組Lovo細(xì)胞熒光強(qiáng)度高于對(duì)照組和無(wú)義ODN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。說(shuō)明轉(zhuǎn)染AS-miR-155可有效下調(diào)Lovo細(xì)胞中miR-155表達(dá)。

2.2 Matrigel基質(zhì)生長(zhǎng)試驗(yàn) 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組和無(wú)義ODN組Lovo細(xì)胞克隆平均直徑分別為(51.28±6.12)μm和(49.35±6.33)μm，轉(zhuǎn)染AS-miR-155組 Lovo細(xì)胞的平均直徑為(28.26±5.38)μm，轉(zhuǎn)染AS-miR-155組平均直徑小于對(duì)照組和無(wú)義ODN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 Transwell細(xì)胞體外侵襲試驗(yàn) 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組和無(wú)義ODN組平均每個(gè)視野穿膜細(xì)胞數(shù)為(70.36±2.8)和(69.2±2.4)，而轉(zhuǎn)染As-miR-155組穿膜細(xì)胞數(shù)為(33.5±2.2)，AS-miR-155組穿膜細(xì)胞數(shù)小于對(duì)照組和無(wú)義ODN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

MicroRNAs是一類短序列、非編碼、具有調(diào)控功能的長(zhǎng)約20 nt-24 nt單鏈小分子RNA。大量證據(jù)表明microRNAs的異常表達(dá)與多種人類癌癥的發(fā)生密切相關(guān)［1］。MicroRNAs的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，為惡性腫瘤的診斷和治療提供了新的靶點(diǎn)。

癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移是大腸癌治療失敗的主要原因之一，積極尋找與大腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物、探討其分子機(jī)制，無(wú)疑會(huì)有助于大腸癌的綜合診療水平。研究表明，miR-155過(guò)表達(dá)和多種上皮系統(tǒng)來(lái)源惡性腫瘤如乳腺癌、大腸癌的發(fā)生及其惡性生物學(xué)表型密切相關(guān)［4，5］。但目前尚不清楚其在大腸癌細(xì)胞侵襲中的作用。本課題組采用反義寡核苷酸敲低miR-155的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組和無(wú)義ODN組比較，miR-155表達(dá)下調(diào)后Lovo細(xì)胞在Matrigel膠上生長(zhǎng)形成克隆的能力降低;且穿過(guò)Transwell小室聚碳酸酯膜的能力下降。由此提示，miR-155過(guò)表達(dá)在大腸癌細(xì)胞向周同正常組織的侵襲過(guò)程中起重要作用。

本研究說(shuō)明，miR-155具有正調(diào)控大腸癌細(xì)胞侵襲性生長(zhǎng)作用，是大腸癌基因治療中的一個(gè)頗具前景的候選靶點(diǎn)。

［1］ Tricoli JV，Jacobson JW.MicroRNA:Potential for Cancer Detection，Diagnosis，and Prognosis.Cancer Res，2007，67(10):4553-4555．

［2］ Faraoni I，Antonetti FR，Cardone J，Bonmassar E.miR-155 gene:a typical multifunctional microRNA.Biochim Biophys Acta，2009，1792(6):497-505．

［3］ Tili E，Croce CM，Michaille JJ.miR-155:on the crosstalk between inflammation and cancer.Int Rev Immunol，2009，28(5):264-84.Review.PubMed PMID:19811312．

［4］ Mattiske S，Suetani RJ，Neilsen PM，Callen DF.The oncogenic role of miR-155 in breast cancer.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2012，21(8):1236-1243．

［5］ Bakirtzi K，Hatziapostolou M，Karagiannides I，et al.Neurotensin signaling activates microRNAs-21 and-155 and Akt，promotes tumor growth in mice，and is increased in human colon tumors.Gastroenterology，2011，141(5):1749-1761．

［6］ Yamanaka Y，Tagawa H，Takahashi N，et al.Aberrant overexpression of microRNAs activate AKT signaling via down-regulation of tumor suppressors in natural killer-cell lymphoma/leukemia.Blood，2009，114(15):3265-3275．

［7］ Fan Y，Zhang YL，Wu Y，et al.Inhibition of signal transducer and activator of transcription 3 expression by RNA interference suppresses invasion through inducing anoikis in human colon cancer cells．World J Gastroenterol，2008，14(3):428-434．

Effects of miRNA-155 on invasion of human corectal cancer cell

MAO Zhen-wei，ZHU Ling，F(xiàn)AN Yu.

Cancer Institute，Affiliated People's Hospital of Jiangsu University，Jiangsu 212002，China

Objective To study the effects of miR-155 on invasion of human colon cells.Methods After human colon cancer Lovo cell were transfected by miR-155 antisense miRNA-155(AS-miR-155).The miR-155 knocking down effects was examined by luciferase reporter assay.Matrigel cell growth assay and Transwell assay were used to determine the growth and invasion abilities of cancer cells.Results Luciferase intensity in As-miR-155 treated Lovo cells was significantly suppressed as compared with that in the control groups(P＜0.05).The diameter of cultured clone in As-miR-155 treated Lovo cells was smaller than that in the control groups.Decreased cells via the transwell member in the AS-miR-155 treatment group were detected as compared with those in the control groups.Conclusion

Over-expression of miR-155 induce the growth and invasion abilitiesof human colon cancer cell．

Colorectal cancer;miR-155;Invasion

江蘇省自然科學(xué)基金(項(xiàng)目編號(hào):BK2009205);鎮(zhèn)江市科技計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào):SH2009014)

212002 鎮(zhèn)江，江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院腫瘤研究所

范鈺