中國南黃海滸苔種群世代結構與生殖條件分析＊

王浩東，姚 雪，池 姍，趙 翠，金月梅，劉 翠，朱明壯，劉 濤＊＊

（中國海洋大學1.海洋生命學院；2.水產學院，山東 青島266003）

滸苔（Ulva prolifera）屬于綠藻門（Chlorophyta）、石莼目（Ulvales）、石莼科（Ulvaceae）、石莼屬（Ulva），是世界范圍內“綠潮”形成的主要種類之一。近年來這種因海水富營養化和氣候異常等因素引起的災難性現象引起了廣泛的重視，產生了許多關于石莼屬物種的生長發育條件的研究，包括適宜其生長的溫度、鹽度、光強等生態因子的范圍［1－5］，CO2、N、Fe、Mn、P等營養元素對其生長的影響［6－8］，以及生活史的研究等［9－13］。

本實驗首先研究了不同地區、不同季節滸苔樣品的世代結構特征，探討了溫度、鹽度和光強等生態因子對其配子和孢子放散速度及放散量的影響，以期為探明綠潮暴發的機制提供科學參考。

表1 實驗材料的采集地信息Table 1 Collection details of Ulva prolifera used in this study

1 材料和方法

1.1 實驗材料

本實驗材料采集于2009年江蘇省沿海，包括了11個站位的35份滸苔樣品，保存于中國海洋大學大型海藻種質庫（樣品采集地分布見表1、圖1）。

圖1 實驗材料的采集地Fig.1 Collection sites of Ulva proliferafrom the Yellow Sea，China

1.2 實驗方法

1.2.1 材料預處理及群體放散測試 對表1中的群體樣品，在濃度為1%的KI－I2溶液中漂洗3～5s以殺死原生動物和附生雜藻，然后用經煮沸的消毒海水沖洗2～3次，再放入500mL燒杯中，保鮮膜加蓋置于溫度18℃、光照強度3 000lx下保存3d，培養液為煮沸過的消毒海水。

在保存期間，對所有群體做放散測試，方法為：在每個群體中選擇10株以上的藻體，用吸水紙吸干，置于4℃、黑暗條件下做低溫干燥刺激放散，處理時間為5min。之后用一次性滴管在藻體中滴加常溫海水，使生殖細胞放散。1min后吸取包含生殖細胞的海水，滴加在潔凈的載玻片上，通以單側光照后，置于OLYMPUS－CX21顯微鏡10倍目鏡下觀察趨光性。滴加約等倍體積的20%KI－I2染液，100倍目鏡下觀察生殖細胞的鞭毛數目，每個群體統計20個以上的生殖細胞鞭毛數目，若觀察到的生殖細胞都為2鞭毛且具有正趨光性，則可認為是配子體群體；若觀測到的生殖細胞都為4鞭毛且具有負趨光性，則可認為是孢子體群體［14］；若2、4鞭毛相混雜且包含2種趨光性的生殖細胞，則認為是孢子體與配子體混合的群體。

1.2.2 實驗設計 經初步鑒定為配子體世代／孢子體世代的材料，每個群體中隨機挑選生長狀態良好一致且在鏡檢中未發生放散的單株藻體，在溫度25℃，鹽度40，光照強度7 000lx的條件下，500mL燒杯保鮮膜加蓋預培養2d。孢子體和配子體分隔培養。

采用三因素三水平完全隨機實驗方案，觀察環境因子對滸苔配子體世代和孢子體世代生殖的影響。溫度設置15、20和25℃3個梯度，鹽度設置10、35、40 3個梯度，光照強度設置3 000、5 000和7 000lx 3個梯度、單側光照，共27個溫度－鹽度－光強組合，配子體分別編號為G1～G27，孢子體分別編號為S1～S27。為防止同一群體內出現不同世代藻體的混雜，之前孢子體和配子體各預培養了2倍數量的藻體。

1.2.3 顯微觀察 培養當天，即可用顯微鏡進行觀察。經連續觀察，每株統計20個以上放散的生殖細胞的鞭毛數目，以確定不同采集地的樣品所處世代是否相同。挑選放散時間相近的不同藻株的配子，將其調整到相當的密度后進行雜交實驗。待生殖細胞充分放散后，對藻體不同部位進行顯微觀察，并用DP71顯微鏡數碼成像系統拍照進行排空率的統計（視野中已經排空的細胞的數量占所有細胞的比例即為藻體的排空率），每株藻體取5個視野分別統計記錄，少量出現異常數值的藻體，進行添加法補充實驗。實驗數據采用Excel 2003軟件進行方差分析，再采用q測驗分析試驗結果均值的差異顯著性。

1.2.4 DNA含量測定 參照方宗熙等的方法制備粒花冠小月螺粗酶液［15］，并添加1.5%的纖維素酶和2mol／L葡萄糖制備為酶解液，在25℃黑暗條件下酶解3h，得到滸苔體細胞原生質體，1 500g離心收集后用－20℃預冷的乙醇溶液固定（終濃度為70%），稀釋為（1～2）×105個／mL細胞懸液，4℃保存。采集滸苔放散的生殖細胞，用－20℃預冷的乙醇溶液固定（終濃度為70%），稀釋為（1～2）×105個／mL細胞懸液，4℃保存。

選取雞紅細胞作為標準參照細胞（DNA含量為2.5pg），1 500g離心收集后加入1mL PBS緩沖液重懸，后加入1mg／mL碘化丙啶（PI）染料50μL染色30min，用Beckman Coulter公司的FC500MPL型流式細胞儀進行細胞DNA含量分析（根據葉綠素熒光強度設門，以排除淀粉酶顆粒等雜質干擾，再根據大小3～5μm設門進行細胞類群的劃分）。

2 結果與分析

2.1 不同地區滸苔樣品的世代鑒定

2.1.1 放散生殖細胞統計 選取12個采集地的28份滸苔樣品的生殖細胞類型進行鑒定（見表2），發現均存在處于孢子體和配子體世代的藻體。春季10個采集地的24份樣品中，13份為配子體世代，11份為孢子體世代。秋季2個采集地的4份樣品，其中2份為孢子體世代，另外2份為孢子體和配子體混雜樣品。

表2 不同地區滸苔樣品放散生殖細胞鞭毛數目的統計及生活史世代的推測Table 2 Number of thallus releasing each type of zoids of Ulva prolifera and presumed generation of life history for each collection site

2.1.2 體細胞及生殖細胞DNA含量測定結果 在研究的12份樣品中，9份鑒定為配子體（配子），2份為孢子體（見表3）。配子（n）及配子體細胞（n）DNA含量在0.118～0.287pg之間（見圖2），孢子體（2n）DNA含量為0.542pg。其中200910096樣品DNA含量為0.349pg，在所測配子體體細胞DNA含量和孢子體體細胞DNA含量之間，因此推測此群體為孢子體和配子體世代混雜群體。根據孢子體和配子體細胞不同DNA含量可以進行滸苔不同世代的快速鑒定（見圖3）。

表3 滸苔體細胞及生殖細胞樣品DNA含量流式測定結果及生活史世代的推測Table 3 DNA contents for gamete and vegetative cells of Ulva prolifera detected by flow cytometry and presumed generation of life history

圖2 滸苔配子樣品流式圖Fig.2Histograms of fluorescence intensity in nuclei isolated from gametes of Ulva prolifera

2.2 環境因子對滸苔不同世代生殖發育的影響

2.2.1 不同環境因子對滸苔配子體世代生殖發育的影響 在27個溫度－鹽度－光強組合中（見表4），溫度25℃、鹽度40和光照7 000lx處理下培養48h后最早開始放散，其余處理組最晚放散時間為培養96h后。生殖放散首先從藻體的頂端開始，放散后藻體發白，隨著放散繼續進行，慢慢地整個藻體都變為白色。放散出的配子在水面上聚集在一起，培養液表層呈明顯的綠色，輕輕晃動燒杯后聚集的配子散開，靜置1h后重新在靠近光源一側聚集，具有正趨光性；同時，經染色后在顯微鏡檢其具有2根頂生鞭毛。挑選采自同一地區的，配子同步放散的處理組，進行了5組雜交實驗，配子存在配對現象，但最終均未融合。連續培養一周后藻體基本放散完畢，但部分藻體內配子未完全排空，統計藻體平均排空率在0.192～0.999之間。

圖3 滸苔孢子體體細胞樣品流式圖Fig.3Histograms of fluorescence intensity in nuclei isolated from protoplasts of Ulva prolifera

表4 溫度、鹽度和光強3個環境因子對滸苔配子體生殖的影響Table 4 Effects of temperature，salinity and light intensity on the reproduction of gametophytes of Ulva prolifera

生態因子對滸苔配子放散實驗結果表明，溫度、鹽度對滸苔配子的放散都有極顯著影響，且鹽度的影響大于溫度，而光照強度對滸苔配子的放散沒有顯著影響（見表5）。3種生態因子中，不僅任意2個生態因子間的交互效應都極顯著，而且3個生態因子之間的交互效應也極顯著。之后對各因素的不同水平進行q測驗以分析其差異顯著性，結果顯示較高溫度（25℃）處理相對于稍低溫度（20℃）處理組對配子釋放量有極顯著影響；較低鹽度（10）處理相對于海水平均鹽度（35）和較高鹽度（40）處理對配子釋放量也有極顯著影響；在光強上，不同強度的光照處理（3 000、5 000和7 000lx）對配子釋放量的影響沒有顯著差別。

表5 溫度、鹽度和光強3個因子對滸苔配子體生殖影響的方差分析Table 5 Variance analysis of effects of temperature，salinity and light intensity on the reproduction of gametophyte of Ulva prolifera

2.2.2 環境因子對滸苔孢子體世代生殖發育的影響

在27個溫度－鹽度－光強組合中（見表6），溫度25℃、鹽度40和光照7 000lx條件下培養24h后最早開始放散，其余處理組最晚放散時間為培養120h后。孢子放散首先從藻體的頂端開始，放散后藻體發白，隨著放散繼續進行，慢慢地整個藻體都變為白色。孢子未在培養液表層聚集，為負趨光性；同時，經染色后在顯微鏡鏡檢發現其具有4根頂生鞭毛，且無融合現象。連續培養一周后孢子基本放散完畢，但部分藻體內孢子未完全排空，統計藻體平均排空率在0.022～0.992之間。

表6 溫度、鹽度和光強3個環境因子對滸苔孢子體生殖的影響Table 6 Effects of temperature，salinity and light intensity on the reproduction of sporophytes of Ulva prolifera

生態因子對滸苔孢子體排放孢子的影響結果（見表7）表明，溫度、鹽度對滸苔孢子的放散都有極顯著影響，且溫度的影響大于鹽度，而光照強度對滸苔孢子的放散沒有顯著影響。3種生態因子中，除溫度與光強的交互效應為顯著外，其他任意2個生態因子間的交互效應都極顯著，并且3個生態因子之間的交互效應也極顯著。對各因素的不同水平進行q測驗以分析其差異顯著性，結果顯示25和20℃處理組相對低溫（15℃）處理對孢子釋放量有極顯著影響；高鹽度（40）處理相對于較低鹽度（10）處理、海水平均鹽度（35）處理對孢子釋放量有顯著影響；不同光照強度處理（3 000、5 000和7 000lx）對孢子釋放量的影響沒有顯著差別。

表7 溫度、鹽度和光強3個因子對滸苔孢子體生殖影響的方差分析Table 5 Variance analysis of effects of temperature，salinity and light intensity on the reproduction of sporophyte of Ulva prolifera

3 討論

3.1 滸苔群體世代結構

滸苔樣品放散生殖細胞的鞭毛數和細胞DNA含量測定的結果均證實了在同一時間、同一地理區域，有不同世代的滸苔并存的現象，這在滸苔自然群體中尚屬于首次發現。Seibin等報道了在緣管滸苔（U.linza）中同一群體內存在的孢子體與配子體混雜的情況［9］。而在本實驗中，對同一采集地不同株藻體放散的配子進行了融合實驗，均未獲得合子，推測其原因，可能是該樣品的各個藻株均是同一親本單性生殖的后代，從而造成自交不親和。這進一步顯示出滸苔生殖特性對于其世代混雜的貢獻，即在配子生殖過程中同時存在著配子單性生殖和配子融合生殖2個途徑，從而在群體的一次生殖過程中出現了配子體（n）和孢子體（2n）2種后代。

3.2 滸苔流式細胞法的世代鑒定

目前為止，在石莼科海藻世代鑒定方面，多數研究主要依靠生殖細胞鞭毛數量和趨光性來探討其所處世代。但在滸苔、緣管滸苔生長發育特性研究中，均發現了其未放散生殖細胞直接在藻體中發育或附生于原藻體表面生長的現象［16－17］，這對于滸苔世代鑒定存在較大的干擾。比較準確地方法是進行染色體制片，觀察其染色體數目，但這種方法存在著操作復雜、檢測效率低等問題。利用熒光染色進行藻體細胞DNA含量檢測是一種比較簡便和快捷的世代鑒定方法。Kapraun等使用顯微分光光度法（染料為DAPI）測定了滸苔和緣管滸苔的單細胞DNA含量，前者約為1.10pg，后者約為0.6pg［18］。Gall等使用流式細胞法（染料為EB）測定了扁滸苔（U.compressa）原生質體的DNA含量，大約為0.26pg［19］，Kagami等使用激光掃描細胞儀（染料為PI）測得的扁滸苔配子體DNA含量為0.28pg，并認為使用配子測量得到的數據比使用從配子體提取的細胞核測量結果更加穩定［20］。本實驗使用流式細胞法（染料為PI）測得的滸苔配子體DNA含量為0.23pg，孢子體DNA含量為0.54pg。不同研究結果顯示出基因組DNA含量差異可能主要來自于檢測方法，顯微分光光度法分析中易受到細胞質中色素體遮擋，干擾了熒光激發強度。利用細胞DNA含量進行世代鑒定需保證供測試樣品的單細胞的完整性以及其活力。本實驗結果顯示，在保證沒有附生藻體的情況下，進行單株藻體生殖細胞觀察可以準確地進行其世代的鑒定，染色體制片較細胞DNA含量測定而言仍是世代鑒定最為可靠的方法；同時，利用流式細胞儀進行微小個體檢測中，也可獲得較為可靠的研究結果。

3.3 環境因子對滸苔不同世代生殖發育的影響

劉峰等認為低鹽度（18）和提高溫度（15和18℃）都有利于黃海綠潮構成種生殖細胞的形成，而低溫會抑制其生殖細胞的形成［7］。本實驗研究顯示，滸苔孢子體和配子體的生殖發育對溫度、鹽度存在著不同的反應機制，鹽度對配子體發育的影響大于溫度，且較高溫度（25℃）處理和較低鹽度（10）處理對配子的放散有更大的促進作用；溫度對孢子體發育的影響大于鹽度，且較高溫度（25℃）處理和較高鹽度（40）處理對孢子的放散有更大的促進作用。而不同強度的光照處理（3 000、5 000和7 000lx）對配子和孢子的釋放量的影響沒有顯著差別。部分已報道的研究結果顯示高光強對孢子釋放的促進作用明顯［1－3］，與本文研究結果不同，可能是與選取的實驗材料生長階段有關，且沒有考慮到不同生態因子之間的交互作用。

溫度、鹽度對滸苔的配子體、孢子體的生殖發育都有極顯著的影響，同時又與光照強度對滸苔配子體、孢子體放散的影響存在交互效應。本研究顯示，在2009年春季在江蘇省近海采樣的樣品中大部分是配子體，受溫度升高和降水增多的影響，促使其進入有性生殖過程，這與夏初降雨后池塘發生滸苔增多的現象相一致。而在秋冬季節，春夏季萌發的孢子體隨著降水減少將促使其無性生殖進入配子體世代。但在滸苔世代交替中，配子體世代同時存在配子融合生殖和配子單性生殖2種途徑，形成了孢子體和配子體世代并存的現象，其生殖條件適宜范圍擴大，在同時受到溫度、降水和光照強度的交互影響下，將潛在地存在“機會窗”（The window of opportunity）事件［21］，在短時間內集中生殖擴散，導致其種群規模的爆發性增長，最終形成綠潮災害。

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