雙氟沙星在異育銀鯽體內(nèi)藥代動力學(xué)研究＊

章海鑫，阮記明，胡 鯤，鄭衛(wèi)東，楊先樂＊＊，王會聰

（1.上海海洋大學(xué)國家水生動物病原庫，上海201306；2.江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所，江西 南昌330039；3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌330045；4.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢430223）

雙氟沙星（difloxacin，DIF）屬于第三代氟喹諾酮類抗菌藥物，其對多種水產(chǎn)致病菌具有良好的作用效果，而且與其他抗菌藥物無交叉耐藥性，已被廣泛的用于防治水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性疾病［1－2］。目前，A.Goudah［3］、M.Ismail［4］、K.Abo－El－Sooud［5］等 國 外 學(xué) 者 報 導(dǎo) 了DIF在小山羊和小羊羔以及小牛、駱駝體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征；此外，豬［7］、兔［8］、雞［9］、甲殼動物［10］等均也有關(guān)于DIF藥代動力學(xué)的相關(guān)報導(dǎo)；Ding F K等［11］詳細(xì)的介紹了不同溫度條件下鯉魚口服DIF后，DIF在血液中的動力學(xué)特征及組織消除情況。以上的研究均為DIF在病害防治中的合理使用提供了有力的理論參考。然而，目前對于DIF特別是其代謝產(chǎn)物沙拉沙星（Sarafloxacin，SAR）在異育銀鯽體內(nèi)的分布、代謝及消除等情況還不是很清楚。因此，本研究采用單次口灌（20mg·kg－1）給藥的方式，研究了DIF及代謝產(chǎn)物SAR在異育銀鯽（Carassais auratus gibebio）體內(nèi)的藥代動力學(xué)規(guī)律，并提出建議休藥期，為水產(chǎn)養(yǎng)殖上DIF的安全使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、藥品及試劑

1.1.1 儀器 Agilent－1100型高效液相色譜儀（四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測器、熒光檢測器及HP化學(xué)工作站）；漩渦混合器；氮?dú)獯蹈蓛x；精密電子天平（METTLER AB104－N）；高速冷凍離心機(jī)；超濾管（Amicon 10kD）等。

1.1.2 藥品及試劑 雙氟沙星（DIF）標(biāo)準(zhǔn)品（含量≥99.9%）、沙拉沙星（SAR）標(biāo)準(zhǔn)品（含量≥99.6%），購于Sigma公司；鹽酸DIF原料藥（純度為98%）由浙江國邦藥業(yè)有限公司提供。乙腈、四丁基溴化氨均為HPLC級；二氯甲烷、正己烷、檸檬酸、檸檬酸三鈉、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉均為分析純，以上藥品均由國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司提供。

1.2 實驗動物與取樣

1.2.1 實驗動物 健康的異育銀鯽（Carassais auratus gibebio）購買于南通某國營農(nóng)場，體重為（80.5±5.3）g，暫養(yǎng)一周后選取100尾實驗，20尾做空白對照。實驗期間使用自動控溫系統(tǒng)控制水溫為（25±1）℃，自然光照，供氧充足；每兩天換水1次，并及時清除水體殘餌和排泄物。

1.2.2 取樣 鹽酸DIF原料藥按20mg·kg－1魚體重標(biāo)準(zhǔn)，用細(xì)導(dǎo)管灌入實驗魚前腸，無回吐現(xiàn)象的留作實驗。分別于給藥后0.017、0.25、0.5、1、2、3、6、12、24、48、72、96、120、144和196h分別取血樣和肌肉、肝臟、腎臟等組織樣品（N＝6），放入－70℃冷凍保藏至樣品處理，給藥前采取同一批實驗魚血液及組織空白樣品。

1.3 樣品處理

1.3.1 血液樣品 取1mL血液加入酸化乙腈（乙腈∶鹽酸∶水＝250∶1∶1）5mL，漩渦混合10min，4℃條件下8 000r／min離心10min，取上清液，45℃恒溫氮?dú)鈼l件下吹干，加1mL流動相溶解，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，HPLC測定。

1.3.2 組織樣品 組織樣品勻漿后精確稱取1.0g，置于10mL離心管中，同時加入1mol／L NaCl和0.2 mol／L PBS緩沖溶液（pH＝7.4）各1mL，再加入5mL二氯甲烷進(jìn)行藥物萃取，漩渦混合振蕩10min后，4℃條件下8 000r／min離心10min，取有機(jī)相；剩余殘渣中再加入5mL二氯甲烷，重復(fù)以上操作步驟進(jìn)行第二次萃取，并合并2次有機(jī)相，于45℃恒溫氮?dú)鈼l件下吹干，加1mL流動相溶解后，加5mL正己烷脫脂；混勻、離心后將下層液體經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，HPLC分析。

1.3.3 雙氟沙星血漿蛋白結(jié)合 血漿蛋白結(jié)合率的測定方法采用 A.Goudah［3］等方法，分別取0.5、1、3、6、12、24h血漿各0.5mL加入超濾管（10KD），4℃條件下12 000g離心120min，收集超濾液。超濾液中加入5mL二氯甲烷，漩渦混合10min，4℃條件下8 000r／min離心10min。取有機(jī)相，45℃恒溫氮?dú)鈼l件下吹干。1mL流動相溶解殘留物，0.45μm微孔濾膜過濾后HPLC測定游離藥物濃度。

1.4 色譜條件

色譜柱為：ZORBAX SB2C－18分析柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動相：V（乙腈）：V（四丁基溴化銨）（0.030mol·L－1、pH＝3.1）＝5∶95；檢測波長276nm；流速1.5mL／min；柱溫40℃；進(jìn)樣量10μL。

1.5 數(shù)據(jù)處理

標(biāo)準(zhǔn)曲線、藥時曲線采用Microsoft Excel繪制；藥物動力學(xué)模型擬合及參數(shù)計算使用3P97藥代動力學(xué)軟件處理。

圖1 DIF及其代謝產(chǎn)物SAR色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of DIF and SAR

2 結(jié)果與分析

2.1 方法確證

DIF與SAR在組織中的檢測采用李海迪等［6］的方法，使用外標(biāo)法計算藥物濃度，在0.01～10μg·mL－1濃度范圍內(nèi)DIF和SAR的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y＝31.173x－3.275，R2＝0.999 3；y＝27.643x－2.980 4，R2＝0.999 8。圖1可以看到組織中DIF與SAR均能夠較好的分離，基線平穩(wěn)，特異性強(qiáng)，重現(xiàn)性好。樣品中DIF和SAR的保留時間分別為9.185～9.613min和10.186～10.216min，檢測限分別為0.01和0.04 μg·g－1。DIF與SAR在各組織中的回收率為90.2%～102.3%，日內(nèi)精密度系數(shù)不大于3%，日間精密度不大于5.8%。

2.2 異育銀鯽體內(nèi)DIF藥物代謝動力學(xué)

DIF在異育銀鯽血液中的藥物時間曲線如圖2所示。結(jié)果顯示，給藥后0.017h血液中就可檢測到DIF，并在0.25h達(dá)到頂峰，達(dá)峰濃度（Cmax）為15.739 μg·mL－1，0.017～0.25h時間段為DIF的體內(nèi)吸收過程。達(dá)峰后濃度開始下降，但在第2h時又可觀察到一個小的吸收峰；2～6h藥物濃度保持在1個較高的水平上；6～24h時藥物濃度又有1個快速下降期，196h時血液藥物濃度降到檢測樣品的最低值。用藥后第1h可在血液中檢測到代謝產(chǎn)物SAR，第2h達(dá)到第一個峰值（1.510μg·mL－1），第3h時有點(diǎn)下降；之后逐步上升，在第120h時SAR濃度達(dá)到了頂峰，隨后快速下降，在第196h時濃度降到檢測樣品的最低值。組織中DIF藥時曲線如圖3所示：DIF在各組織中的藥時曲線趨勢一致，均有2個吸收峰；達(dá)峰時間腎臟（0.25h）快于肝臟（0.5h）快于肌肉（3h）；Cmax則是肝臟（67.750μg·g－1）＞腎臟（36.630μg·g－1）＞肌肉（17.870μg·g－1）。

圖2 血液中單次口灌20mg·kg－1 DIF藥時曲線Fig.2 The concentration－time curves of DIF and SAR in plasma following a single oral gavage of 20mg·kg－1

血液與組織中DIF藥代動力學(xué)參數(shù)見表1，從表中可以看到DIF消除半衰期（T1／2β）表現(xiàn)為血液最快，肝臟快于腎臟，肌肉組織中最緩慢；清除速率（CL）表現(xiàn)為血液最快，腎臟快于肝臟，肌肉最慢；曲線下面積（AUC）表現(xiàn)為肌肉最大，肝臟大于腎臟，血液最小。

表1 口灌20mg·kg－1 DIF血漿和組織中藥代動力學(xué)參數(shù)Table 1 Pharmacokinetic parameters of DIF in plasma and tissues following a single oral gavage of 20mg·kg－1

圖3 肝臟、腎臟、肌肉組織中單次口灌DIF 20mg·kg－1藥時曲線Fig.3 The concentration－time curves of DIF in tissues following a single oral gavage of 20mg·kg－1

2.3 DIF在異育銀鯽體內(nèi)的房室模型與血漿蛋白結(jié)合率

25℃水溫條件下，以20mg·kg－1劑量給異育銀鯽單次口灌DIF藥液后，使用3P97藥代動力學(xué)軟件分析血液藥物時間濃度數(shù)據(jù)，結(jié)果均符合開放性二室模型。二室模型結(jié)構(gòu)如圖4所示，由圖可知中央室向外周室轉(zhuǎn)運(yùn)的速率（K12）＞外周室向中央室轉(zhuǎn)運(yùn)速率（K21）；總體表觀分布容積（Vb）由血漿分布容積（Vc）和組織分布容積（Vp）組成，為2.158mL·kg－1；總體消除速率Ke為0.091h－1。各時間點(diǎn)血漿蛋白結(jié)合率結(jié)果見圖5，可知結(jié)合率為52.39%～64.10%，24h時結(jié)合率顯著高于其他時間點(diǎn)。

2.4 代謝產(chǎn)物SAR的分布與殘留

DIF代謝產(chǎn)物SAR組織藥時曲線（見圖6）所示，在用藥后的第0.017h肝臟和腎臟均可觀察到SAR，其Cmax分別為16.640和8.340μg·g－1，并分別占肝臟和腎臟DIF峰濃度的24.56%和22.77%。肌肉組織中雖然也可觀察到SAR的存在，但肌肉組織中SAR的濃度一直處在較低的水平內(nèi)波動，只在第3h時出現(xiàn)1個小峰，且達(dá)峰濃度不高。

3 討論

3.1 DIF在異育銀鯽體內(nèi)的吸收與分布

目前，在人、畜禽和水產(chǎn)動物上均有關(guān)于DIF藥代動力學(xué)的研究［7－13］。本實驗中DIF各組織藥物濃度時間數(shù)據(jù)均可用開放性二室模型進(jìn)行擬合。血液組織中DIF吸收半衰期 T1／2Ka短于豬［7］、雞［9］和鯉［11］，但長于中華絨螯蟹［10］。表觀分布容積Vd值小于中華絨螯蟹，稍大于鯉；A.Goudah等［3］給小山羊和小羊羔靜脈注射DIF后，發(fā)現(xiàn)小山羊和小羊羔體內(nèi)的Vd值為0.048和0.049L·kg－1，而 M.Ismail等［5］和 K.Abo－El－Sooud等［4］分別使用靜脈注射的方法研究了小牛仔和駱駝體內(nèi)DIF藥代動力學(xué)時，發(fā)現(xiàn)Vd值分別為1.120和1.020L·kg－1，這些結(jié)果都明顯的低于實驗結(jié)果。DIF在異育銀鯽體內(nèi)血漿蛋白結(jié)合率高于小山羊和小羊羔體內(nèi)的10.32%和12.98%，也高于小牛仔和駱駝體內(nèi)的31.7%～36.8%和28%～43%［3－5］。表明DIF在異育銀鯽體內(nèi)較易吸收，但其在體內(nèi)的分布程度除了與動物的個體種類及給藥方式有關(guān)外，異育銀鯽體內(nèi)較高的血漿蛋白結(jié)合率使得DIF具有較高的血液分布容積也有一定的關(guān)系。

組織中，給藥后0.25h腎臟就達(dá)到吸收峰，肝臟和肌肉也分別在0.5和3h達(dá)到吸收峰，達(dá)峰濃度肝臟高于腎臟高于肌肉。實驗結(jié)果與Ding F K等［11］和楊先樂等［12］研究結(jié)果一致。組織中K12和K21的值均不等且K12／K21＞2，可見DIF從中央室向周邊室轉(zhuǎn)運(yùn)后，在周邊室滯留的時間較長也直接導(dǎo)致了藥物在血液中的清楚速率，這與錢云云等［13］的研究結(jié)果一致。表明，肝、腎組織在給藥前期能夠儲存DIF。比較各組織中的曲線下面積（AUC），發(fā)現(xiàn)肌肉組織的AUC稍大于肝臟和腎臟，錢云云等［13］研究恩諾沙星在羅氏沼蝦體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)時也發(fā)現(xiàn)AUC大于肌肉，而李海迪等［10］發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹中DIF組織AUC肝胰臟最大，表明DIF在動物體內(nèi)的吸收與分布具有物種差異性。譚超等［14］研究單諾沙星在鯽魚體內(nèi)代謝動力學(xué)時也得出單諾沙星在動物體內(nèi)吸收具種屬差異性的結(jié)果。

綜上所述，異育銀鯽體內(nèi)，DIF進(jìn)入血液后，會有部分藥物與血漿蛋白發(fā)生結(jié)合，游離藥物則快速的進(jìn)入肝臟和腎臟組織，然后代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)入血液和消除。

3.2 DIF在異育銀鯽體內(nèi)的消除和代謝

CL和T1／2β是反映藥物在機(jī)體內(nèi)消除快慢的藥代參數(shù)。實驗中，DIF在組織間清除率相差不大，與恩諾沙星在虹鱒體內(nèi)采用血管內(nèi)給藥的體清除率（0.058 L·h·kg－2）［15］比較接近；但均大于在中華絨螯蟹組織中的清除率（0.008～0.040L·h·kg－2）［10］。A.Goudah［3］與 M.Ismail［5］也發(fā)現(xiàn)小山羊、小羊羔和小牛仔的CL值小于0.1L·h·kg－2。異育銀鯽組織中DIF的消除半衰期小于其在中華絨螯蟹組織中的半衰期（67.01～137.52h）［10］，但大于高等脊椎動物［3，5，7，9］，表明DIF在異育銀鯽體內(nèi)的消除較慢，但快于中華絨螯蟹。楊先樂［12］認(rèn)為，甲殼類主要通過觸角腺及肝胰腺對藥物進(jìn)行排泄和降解，而魚類等可以通過腎、呼吸器官等進(jìn)行擴(kuò)散消除，因而不同動物種屬間代謝器官的差異，造成其對藥物代謝消除機(jī)能的差別。

異育銀鯽肝臟、腎臟和肌肉組織中第2h均出現(xiàn)DIF濃度在峰谷，但此時代謝產(chǎn)物SAR均出現(xiàn)吸收峰；可以推測第2hDIF在肝臟和腎臟中顯著下降的原因可能是DIF被大量的代謝。DIF的主要代謝部位為肝臟和腎臟，參與DIF代謝的主要代謝酶主要存在肝臟和腎臟組織等組織中［16－17］。于靈芝等［18］研究發(fā)現(xiàn)DIF代謝酶在腎細(xì)胞孵育2h時表達(dá)量達(dá)最高；Guihong Fu等［19］研究發(fā)現(xiàn)第2h時，DIF濃度在肝臟組織中出現(xiàn)峰谷，而其代謝酶CYP1A1基因表達(dá)量最高，這些研究結(jié)果都與本實驗結(jié)果一致。

DIF通過脫甲基作用代謝為具有活性的SAR［20］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)各組織中SAR的達(dá)峰濃度占各組織DIF峰濃度的比例不一樣，最高的為肝臟，然后腎臟，最后是血漿和組織。這種代謝的組織差異在豬、雞及中華絨螯蟹上都有報道［7，9，10］，其他的喹諾酮類藥物也有類似的報導(dǎo)［21］。血液組織中代謝產(chǎn)物SAR表現(xiàn)為多封現(xiàn)象，這與李海迪等［10］和Jun Tang等［21］研究的結(jié)果相似；同時血液組織中觀察到SAR的時間晚于肝、腎組織，說明代謝產(chǎn)物SAR在組織中是一種活性成分，能夠在體內(nèi)再分布和消除。由此可見，肝臟和腎臟既是代謝產(chǎn)生SAR的組織又是清除SAR的主要組織。

3.3 給藥建議與休藥期

姜春椿等［22］報導(dǎo)了鹽酸二氟沙星對革蘭氏陽性菌、腸菌、假單胞菌及厭氧菌的最低抑菌濃度（MIC）；楊雨輝等［23］也測定了二氟沙星對嗜水氣單胞菌的MIC和最小殺菌濃度（MBC），其中二氟沙星對嗜水氣單胞菌的 MIC和 MBC分別為0.2和0.8mg·L－1，表明DIF是一種較好的抗菌藥物。通常我們使用Cmax／MIC90和 AUC0－24／MIC90兩個比值來評價藥物劑量的臨床效果，當(dāng)Cmax／MIC90≥10和 AUC0－24／MIC90≥120時，說明藥物劑量臨床效果較好［24］。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)，使用Cmax／MIC90≥10來預(yù)測臨床給藥方案。在25℃水溫條件下，口服劑量為20mg·kg－1時，DIF有效濃度保持時間可達(dá)4～6h。所以建議在治療異育銀鯽一般性細(xì)菌性疾病時，常溫條件下（25℃左右），口服劑量為20mg·kg－1，2次／d，連用3d。

另外，休藥期是根據(jù)國家規(guī)定的最大殘留限量（MRL）標(biāo)準(zhǔn)和動物對藥物殘留消除規(guī)律來確定。目前歐盟規(guī)定的DIF在所有食品的物種中的殘留限量分別為肝（800μg·kg－1）、肌肉（300μg·kg－1）、腎（600μg·kg－1），而SAR在動物性食品中的最大殘留限量為30μg·kg－1，據(jù)此可以計算出各組織中DIF消除殘留低于最大殘留限量的時間為肌肉432h（18d）、肝96h（4d）、腎264h（11d）；因此建議在25℃環(huán)境溫度下，DIF在異育銀鯽上的休藥期應(yīng)大于18d。

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