1，25-二羥維生素D3對大鼠腎間質纖維化的作用研究

榮智利，張 旭，張翠薇，高 岑，江 燕，馬躍榮

瀘州醫學院病理教研室，四川瀘州 646000

腎間質纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是一個多步驟、連續的動態過程，是各種慢性腎臟疾病發展至終末期的共同通路和主要病理改變[1]，其變化的程度和范圍決定了腎功能的惡化程度[2-4]。單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）大鼠是一種經典的RIF動物模型，既可短期內致使腎間質纖維化，模擬慢性腎病時腎間質的病理表現，又可使病變局限在腎小管和腎間質，不引起腎小球及其他組織的損傷[5]。近期研究顯示，1，25-二羥維生素 D3〔1，25-dihydroxyvitamin D3，1，25-（OH）2D3〕 主要通過與其特異性受體結合發揮經典的骨鹽調節作用，并參與免疫調節、調控激素分泌和細胞有絲分裂、抑制細胞增殖、分化及凋亡等過程[6]。 1，25-（OH）2D3受體可選擇性表達于腎臟的近曲小管、遠曲小管、集合管和髓袢升支[7]，但其是否在RIF形成過程中發揮作用不詳。本研究利用1，25-（OH）2D3干預UUO大鼠，觀察其對RIF形成有無影響，以探討其在RIF過程中的作用。

1 儀器與試藥

1.1 實驗動物

雄性 SD 大鼠，45 只，8 周齡，體重（200±20） g，購自瀘州醫學院醫學實驗動物中心。

1.2 藥物和主要試劑

1，25-（OH）2D3（Roche 公司，美國），兔抗大鼠 α-SMA 多克隆抗體（Santa Cruz公司，美國），尿蛋白雙縮脲試劑盒（Amresco公司，美國）。

2 方法與結果

2.1 實驗方法

2.1.1 實驗動物分組及處置 45只SD大鼠隨機均分為假手術組、UUO 組和 1，25-（OH）2D3干預組，每組各 15只。 采用單側輸尿管結扎建立UUO大鼠模型[8]。1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，局部剃毛和常規消毒鋪巾，選腹正中切口依次切開皮膚至腹腔，游離腎臟及輸尿管，分別在左側輸尿管近腎盂處和輸尿管上1/3處用1-0絲線兩次結扎，剪斷輸尿管，然后逐層連續縫合皮膚。假手術組進入腹腔后僅游離腎臟和輸尿管而不結扎離斷，余手術方式與UUO組相同。干預組于術后第 1天起每天腹腔注射 30 ng/（kg·d）的 1，25-（OH）2D3[9]，假手術組及UUO組每天腹腔注射等量生理鹽水。分別于術后第3、7和14天處死大鼠，每次5只，取梗阻側腎臟測量其大小及形態，固定包埋后，制片行HE、Masson和α-SMA染色；開胸經心臟取血檢測肌酐和尿素氮水平；各組大鼠于處死前1天收集24 h尿液，檢測尿蛋白含量。

2.1.2 腎臟病理檢查 每張HE、Masson和α-SMA切片隨機選取10個不重復視野（×200，HPF），組內求和取其平均值作為每組最終數據。①HE染色判定腎間質損傷及纖維化程度：HE切片依據Radford[10]標準設定8個參數指標（腎小管擴張、小管萎縮、小管上皮細胞空泡變性、間質水腫、間質炎細胞浸潤、間質纖維化程度、紅細胞管型、蛋白管型），每個參數按0～3分評定（0分，正常；1分，輕度受損，病變范圍＜15%；2分，中度受損，病變范圍15%～50%；3分，重度受損，病變范圍＞50%），由兩個觀察者盲法評分取其平均值，每個樣本的評分為0～24分。②Masson染色判定纖維化程度：Masson染色是用于顯示組織中纖維的一種染色方法，染色切片中膠原纖維呈綠色，肌肉、纖維素和紅細胞均呈紅色，細胞核呈藍色，正常腎組織中僅腎小管基底膜染成綠色。RIF進程中膠原纖維逐步取代正常腎單位，腎實質萎縮減少。本實驗通過對膠原纖維染色，運用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算鏡下綠染面積占整個視野的百分比，以了解受損腎臟的纖維化程度。③α-SMA免疫組化染色：在本實驗中α-SMA用于標記肌成纖維細胞（myofibroblast，MFB），其陽性信號為細胞胞漿呈現棕黃色顆粒。運用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算染色陽性細胞的積分光密度值（指將陽性細胞內染色量化為綜合面積和灰度值所得到的結果，其值越大，提示抗原表達水平越高，反之亦然）。

2.1.3 腎功能檢測 采血后3 000 r/min離心分離血清，于日本7180型全自動生化分析儀上檢測血肌酐、尿素氮水平（此血生化檢查由瀘州醫學院附屬醫院檢驗科協助完成）；根據尿蛋白雙縮脲試劑盒的操作說明，檢測24 h尿蛋白含量。

2.1.4 統計學方法

用SPSS 17.0統計軟件進行統計學處理，所有數據采用均數±標準差（±s）表示，多組間計量資料比較用單因素方差分析（One-way ANOVA test），兩兩比較采用 Dunnett-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2.2 腎臟病理學改變結果

2.2.1 肉眼病理改變 假手術組患側腎臟大小形態正常；UUO組和干預組梗阻側腎臟均明顯腫大，顏色變淺，表面張力增加，有尿液潴留，切面腎實質變薄，腎盂腎盞擴張，皮髓質分界不清，腎乳頭缺血萎縮，并隨著時間的延長而加重，以UUO組病變更為明顯。

2.2.2 光鏡下病理改變 ①HE切片假手術組各時間點腎組織無明顯改變。UUO組術后第3天腎小管輕度少量擴張，上皮細胞濁腫變性，腎間質輕度水腫，伴炎細胞局灶性浸潤；術后第7天，腎小管進一步擴張，以皮髓交界處尤為明顯，上皮細胞空泡變性，管腔內見細胞或蛋白，伴炎細胞彌漫性浸潤和部分小管間質輕度纖維化；術后第14天，皮髓質變薄，小管擴張明顯，甚至擴張呈囊性，部分管腔塌陷，上皮細胞空泡變性顯著，出現大量壞死，間質內巨噬細胞、淋巴細胞彌漫性浸潤和成纖維細胞增生及膠原形成，纖維化明顯，各時間點腎間質評分差異明顯，有統計學意義（P＜0.05）。②Masson切片顯示假手術組綠染區域主要位于小管基底膜及其周圍，小管間質幾乎無染色。術后第3天，UUO組皮髓交界區出現輕度纖維化，并隨著梗阻時間的延長綠染面積擴大，表現為腎間質進行性增寬，膠原纖維增加，染色加深，各時間點綠染面積所占百分比比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。③假手術組α-SMA僅表達于血管平滑肌細胞，腎小球、腎小管及間質均未見表達。UUO組術后第3天可見腎間質內α-SMA少量表達；術后第7天腎小管上皮細胞出現陽性表達，皮髓交界處出現輕微纖維化；術后第14天表達達到高峰，皮質區和皮髓交界區明顯，各時間點α-SMA的累積光密度值（IOD）比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。④干預組與假手術組相比，各時間點各項指標明顯增高；而較之UUO組，各時間點各項指標明顯改善，其腎損傷、間質纖維化程度及α-SMA陽性率明顯改善，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 各組大鼠不同時間點光鏡下病理改變（±s，n=5）

表1 各組大鼠不同時間點光鏡下病理改變（±s，n=5）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與 UUO 組比較，bP＜0.05；與第 3 天比較，cP＜0.05；與第 7 天比較，dP＜0.05

動物處死時間第3天 第7天 第14天HE腎間質損傷評分（分）Masson綠染面積百分比（%）α-SMA的IOD值檢查指標 組別假手術組UUO組干預組假手術組UUO組干預組假手術組UUO組干預組1.20±0.84 4.40±1.14a 2.80±0.85ab 3.21±0.33 5.39±0.61a 3.98±0.14ab 197.65±0.87 433.91±23.08a 325.92±20.28ab 1.20±0.45 13.60±2.51ac 9.60±1.14abc 3.26±0.40 12.14±1.57ac 3.98±0.14abc 199.29±3.26 656.55±23.47ac 461.98±21.93abc 1.00±0.71 19.80±1.48acd 14.20±1.30abcd 3.37±0.47 47.19±2.86acd 31.59±2.36abcd 198.23±1.50 856.00±21.15acd 595.54±6.75abcd

2.3 各組腎功能比較結果

圖1 各組大鼠第14天腎臟HE、Masson、a-SMA染色比較（×200）

與假手術組相比，術后第3、7和14天UUO組與干預組肌酐、尿素氮及24 h尿蛋白含量均明顯高于假手術組，差異有統計學意義（均P＜0.05），其中第3、7天各指標呈現上升趨勢，第14天時表現為下降；與UUO組相比，干預組各時間點各項指標明顯改善，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；而假手術組術后各時間點各項指標差異不明顯，差異無統計學意義（P＞0.05）。 見表 2。

表2 各組大鼠不同時間點腎功能變化（±s，n=5）

表2 各組大鼠不同時間點腎功能變化（±s，n=5）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與 UUO 組比較，bP＜0.05

動物處死時間第3天 第7天 第14天血肌酐（μmol/L）尿素氮（mmol/L）24 h尿蛋白（mg/24 h）檢查指標 組別假手術組UUO組干預組假手術組UUO組干預組假手術組UUO組干預組36.60±0.99 77.46±0.98a 54.42±0.60ab 4.98±0.29 5.04±0.26 7.34±0.17ab 11.64±0.38 13.00±0.24a 12.52±0.39ab 37.10±0.62 148.48±7.49a 83.10±0.77ab 5.04±0.26 18.16±0.36a 11.22±0.36ab 11.56±0.18 23.56±0.47a 16.98±0.47ab 36.94±0.92 69.82±0.98a 52.36±0.69ab 5.04±0.13 10.02±0.23a 8.96±0.27ab 11.58±0.19 15.94±0.34a 13.48±0.43ab

3 討論

RIF發生機制錯綜復雜，可概括為細胞外基質增多、腎小管上皮細胞轉分化 （epithelial tmesenchymal transition，EMT）和多種細胞因子及血管活性物質的激活與相互作用。近年研究表明，MFB的激活是RIF形成的關鍵[11]，而其中1/3的MFB由EMT而來[12]，這種EMT的細胞過度增殖，可分泌多種細胞因子致使細胞外基質合成與降解失衡，最終導致RIF的發生。RIF的病理過程是由病變初期的炎癥細胞浸潤，繼而EMT發生和腎間質成纖維細胞活化增殖，共同產生大量細胞外基質并發生沉積，最后腎小管萎縮消失，小管間質纖維化[4]。正常成熟的腎小管上皮細胞表達角蛋白，腎間質細胞表達波形蛋白，均無α-SMA的表達；而MFB是成纖維細胞的活化形式，胞漿內含肌動蛋白，可表達α-SMA。MFB廣泛存在于纖維化腎組織中，因此α-SMA作為MFB的重要標志，可指示RIF的病理進程[13]。而RIF又與腎功能關系密切，可作為準確預測腎功能惡化程度的指標[3]。UUO模型是目前研究RIF最常用的較成熟模型，具有無高血壓、蛋白尿、血脂異常及毒性損害等特點，適合RIF病理機制和防治的研究[5]。1，25-（OH）2D3主要通過與其受體結合發揮其多樣生物學作用，如參與維持鈣磷平衡；與其他轉錄因子相互作用，影響基因轉錄；與其他激素、生長因子及細胞因子等相互作用，參與聯系多個信號傳導途徑，從而發揮復雜而精細的調節作用。有研究表明，腎功能降低與血清中1，25-（OH）2D3的減少呈正比關系[14]。這就說明1，25-（OH）2D3可通過某些途徑對腎功能起保護作用，減緩腎臟的病理改變。

本實驗結果顯示，隨著時間延長，UUO組腎間質損傷和纖維化程度逐漸加重，α-SMA標記陽性的MFB逐漸增多；至術后第14天，腎間質纖維化明顯，α-SMA表達達到高峰。而肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白水平于術后第3、7天與梗阻側腎臟損傷相平行，各項指標明顯升高；至第14天，各項指標明顯改善，這可能與實驗所取血液為全身血液，而此時健側腎臟發揮了全面代償作用有關。干預組與UUO組各時間點相比，干預組各項指標改善明顯。另有體外實驗證明，1，25-（OH）2D3能抑制轉化生長因子-β1（tranforming growth factor-β1，TGF-β1）誘發的 α-SMA 表達，并呈劑量依從關系[15]。TGF-β1是目前已知最強烈的促纖維化因子，可誘導EMT和成纖維細胞活化；而1，25-（OH）2D3的體內信號傳導途徑與TGF-β1存在有廣泛交互的作用[16]。 1，25-（OH）2D3在 RIF 中發揮保護作用的可能機制是通過拮抗TGF-β1誘導的EMT和減少蛋白尿而實現的。

RIF是一個多因子參與、多路徑調控的復雜病理過程，其機制還有待進一步的研究。本研究對1，25-（OH）2D3在RIF中所起的干預作用作了初步探討，為進一步研究RIF發病機制及尋找治療方法提供了一定證據和思路。

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