芡實淀粉的酶解特性及體外消化模擬分析

張 汆，魏兆軍，袁懷波，張 曼

(1.滁州學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，安徽 滁州 239000；2.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

芡實淀粉的酶解特性及體外消化模擬分析

張 汆1，魏兆軍2，袁懷波2，張 曼1

(1.滁州學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，安徽 滁州 239000；2.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

研究芡實淀粉的酶解特性及其在模擬過程中的消化特性。采用α-淀粉酶水解法，以酶解液中還原糖釋放率為指標(biāo)，對芡實淀粉的酶解特性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，α-淀粉酶的最優(yōu)酶解條件為：α-淀粉酶用量350U/g、底物質(zhì)量濃度為10g/100mL、pH值為6，于50℃水浴中水解60～80min。在此條件下，芡實淀粉酶解液中還原糖釋放率可達(dá)79.61%。體外消化模擬結(jié)果顯示，芡實淀粉在模擬消化中的還原糖和可溶性糖釋放率均遠(yuǎn)低于酶解過程；且與米淀粉相比，芡實淀粉較難消化。研究認(rèn)為，芡實淀粉在α-淀粉酶作用下，較易水解；消化模擬過程中，芡實淀粉的可消化性稍低于米淀粉，可能與其中殘留的植物多酚類物質(zhì)有關(guān)。

芡實淀粉；α-淀粉酶；酶解；消化模擬

芡實是睡蓮科(Nymphaeaceae)芡屬植物(Euryale Salisb. ex DC.)芡(Euryale feroxSalisb.)的成熟種仁，又稱雞頭米。芡實是一種藥食兼用的材料，具有多種保健功能。我國中醫(yī)認(rèn)為，芡實具有顯著的治療和保健功能。《神農(nóng)本草經(jīng)》認(rèn)為其具有“補中除暑疾，益精氣，強志令耳目聰明”等作用[1]。《本草綱目》中也有“芡能止渴益腎，治小便不禁、遺精、白濁、帶下”的記載[2]。在我國民間也一直流傳有許多包含芡實的中藥方劑或藥膳配方。現(xiàn)代分析研究也表明，芡實提取物顯示較高的生理活性和保健功能[3-4]。

目前，有關(guān)芡實的研究主要集中于其營養(yǎng)[5-6]、加工[7-9]、生理活性及其機理[10-12]方面，對芡實淀粉的相關(guān)報道較少[13-14]。芡實淀粉在掃描電子顯微鏡下，芡實淀粉顆粒呈不規(guī)則多面體，平均粒徑為1.2～6.5μm，與米淀粉粒徑相近(2～10μm)，屬于小顆粒淀粉[14-15]。芡實淀粉分子結(jié)構(gòu)中，直鏈淀粉和支鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為18.37%～23.06%和37.66 %～48.30%，支鏈與直鏈比值為 1.63～2.55[15]。

系統(tǒng)了解芡實原料的基本組成及其功能特性是研究開發(fā)芡實深加工產(chǎn)品的基本前提。作為芡實中含量最高的生物大分子，芡實淀粉的顆粒結(jié)構(gòu)及其營養(yǎng)、功能特性直接影響芡實產(chǎn)品的加工條件和品質(zhì)特性。目前有關(guān)芡實淀粉營養(yǎng)和功能特性方面的文獻(xiàn)報道很少。該研究采用酶解和體外模擬消化的方法，對芡實淀粉的酶解特性和消化過程進(jìn)行初步研究，為系統(tǒng)了解芡實淀粉在人體的消化過程及營養(yǎng)特性提供較直接的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

帶殼新鮮芡實，由滁州市天長市勝達(dá)芡實經(jīng)濟(jì)專業(yè)合作社提供；經(jīng)40℃干燥，手工去除種殼，粉碎(過80目篩網(wǎng))，得到芡實全粉，裝入聚乙烯自封袋內(nèi)，于4℃冰箱貯存，備用。米淀粉 實驗室自制。

α-淀粉酶(比活力5000U/g，最適pH 5.5～7.5，最適溫度50～75℃，將其配制成為酶活力250U/mL的酶液，備用) 天津市福晨化學(xué)試劑廠。

無水乙醚、丙酮、硫酸銅、硼酸、蔗糖、葡萄糖、苯酚、四水合酒石酸鉀鈉、高氯酸、濃硫酸、氫氧化鈉、3,5-二硝基水楊酸 國藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CP224s型電子天平 德國Sartorius AG 公司；L-550型離心機 湖南湘儀離心機廠；DGX-9073BC-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海福瑪實驗設(shè)備有限公司；712E型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；KDN-102F型自動定氮儀上海纖檢儀器有限公司；HYP-1004型消化爐上海纖檢儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 組分測定[16]

粗蛋白質(zhì)含量測定：采用GB/T5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測定》凱氏定氮法；水分測定：采用GB/T 5009.3—2003《食品中水分的測定》直接干燥法；灰分測定： 采用GB/T5009.4—2003《食品中灰分的測定》灼燒法；芡實粗纖維的測定：采用質(zhì)量法；淀粉測定：采用苯酚-硫酸法；還原糖測定：采用3,5-二硝基水楊酸比色法；可溶性糖測定：采用苯酚-硫酸法；總酚含量測定：采用Folin-Ciocalteus(FC)試劑法，以焦性沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行測定[17]。

1.3.2 芡實淀粉制備[14,18]

芡實中含有一定量的植物多酚，會導(dǎo)致淀粉變色，必須除去。稱取一定量芡實全粉，體積分?jǐn)?shù)50%的丙酮水溶液浸提2～3次，離心分離，棄上清液，取沉淀。

于沉淀物中加入20倍量的0.01mol/LNaOH溶液，攪拌浸提3～5次(以脫除蛋白質(zhì)組分)，離心分離，棄上清液，收集沉淀。將沉淀用去離子水漂洗至中性，懸浮于水中，用3層紗布過濾，濾液抽濾分離，得濾餅，于40℃條件下干燥，即得芡實淀粉。

1.3.3 芡實淀粉酶解處理及水解程度分析[19]

稱取芡實淀粉，按比例加入去離子水，于90℃水浴中糊化30min，取出，冷卻后，按實驗計劃加入α-淀粉酶液，在設(shè)定條件下進(jìn)行酶解。酶解結(jié)束后，于沸水浴中滅酶15min，取出，冷卻至室溫，4000r/min離心5min，取上清液，沉淀用水重復(fù)提取1次，離心，合并上清液于容量瓶內(nèi)，定容，即得芡實淀粉水解液。以水解液中還原糖(或可溶性糖)含量表示芡實淀粉的水解程度。計算還原糖釋放率和可溶性糖釋放率。

式中：m1為水解液中還原糖質(zhì)量/g；m2為水解液中可溶性糖質(zhì)量/g；m為樣品中淀粉質(zhì)量/g。

1.3.4 芡實淀粉體外消化模擬[20]

分別稱取一定量的芡實淀粉和米淀粉加蒸餾水配制成質(zhì)量濃度約10g/100mL的淀粉懸浮液，于沸水中糊化20min，冷卻，加入約1/2體積的人工胃液(用0.5mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值在1.5 左右)，在37℃水浴中保溫3h。每20min取5mL消化液于離心管中，立刻加入1mL 0.2mol/L的NaCO3溶液以終止消化，4000r/min離心10min，取上清液定容，測定其中的還原糖和可溶性糖含量。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)重復(fù)測定3次，結(jié)果取平均值。采用Excel軟件和DPSv7.55數(shù)據(jù)處理軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 芡實組分分析

表1 芡實樣品組分分析Table 1 Compositions of chemical composition of gorgon nut flour,gorgon nut starch and rice starch

由表1可知，芡實中的主要營養(yǎng)組分為淀粉和蛋白質(zhì)，其含量與谷物接近。因芡實全粉中含有較豐富的植物多酚物質(zhì)，易氧化褐變，須經(jīng)50%丙酮水溶液脫除多酚，再以稀堿液脫除其中蛋白質(zhì)，所得芡實淀粉色澤亮白，質(zhì)地細(xì)膩，淀粉含量超過91%。所得米淀粉基本組分與芡實淀粉相近，其中，芡實全粉中富含植物多酚(可提取總酚含量0.93mg/g)，因此所得芡實淀粉中仍殘留有少量多酚類物質(zhì)(0.12mg/g)，相比之下，米淀粉中所含總酚較低(0.03mg/g)，遠(yuǎn)低于大米原料中的總酚含量(0.36mg/g)。

2.2 芡實淀粉酶解條件

2.2.1 酶用量

在芡實淀粉質(zhì)量濃度為10g/100mL，pH值中性條件下，于40℃水浴中酶解30min，以水解液中還原糖釋放率為指標(biāo)，分析不同α-淀粉酶用量對芡實淀粉水解程度的影響。

圖1 α-淀粉酶用量對芡實淀粉水解程度的影響Fig.1 Effect of enzyme dosage on reducing sugar release from gorgon nut starch

由圖1可知，隨α-淀粉酶用量的增加，還原糖釋放率顯著增加(P＜0.05)。當(dāng)酶用量增加至250U/g以上時，還原糖釋放率變化不大。因此，取α-淀粉酶用量為250U/g。

2.2.2 芡實淀粉質(zhì)量濃度

在α-淀粉酶用量為250U/g，pH值中性條件下，于40℃水浴中水解30min，分析淀粉質(zhì)量濃度對芡實淀粉酶解過程的影響。

圖2 淀粉質(zhì)量濃度對芡實淀粉水解程度的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on reducing sugar release from gorgon nut starch

由圖2可知，隨芡實淀粉質(zhì)量濃度增加，還原糖釋放率顯著降低(P＜0.01)，其中還原糖釋放率在芡實淀粉質(zhì)量濃度＞10g/100mL時迅速降低。因此α-淀粉酶酶解芡實淀粉的適宜的淀粉質(zhì)量濃度為10g/100mL。

2.2.3 體系pH值

在芡實淀粉質(zhì)量濃度為10g/100mL，α-淀粉酶用量250U/g的條件下，于40℃水浴中水解30min，分析體系pH值對芡實淀粉酶解過程的影響。

圖3 pH值對芡實淀粉水解程度的影響Fig.3 Effect of hydrolysis pH on reducing sugar release from gorgon nut starch

由圖3可知，pH值在6左右時，還原糖釋放率顯著增加(P＜0.05)。此后，隨pH值的增加，偏離了α-淀粉酶的最佳pH值范圍，酶活降低，還原糖釋放率迅速降低。因此，α-淀粉酶酶解芡實淀粉的適宜pH值為6～7。

2.2.4 酶解溫度

在芡實淀粉質(zhì)量濃度為10g/100mL，α-淀粉酶用量250U/g的條件下，于水浴中水解30min，分析酶解溫度對芡實淀粉水解的影響。

圖4 酶解溫度對芡實淀粉水解程度的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on reducing sugar release from gorgon nut starch

由圖4可知，酶解溫度在10～60℃范圍內(nèi)，隨溫度升高還原糖釋放率增加顯著(P＜0.05)。在酶解溫度為80℃時，因高溫導(dǎo)致α-淀粉酶鈍化，還原糖釋放率迅速降低。因此，α-淀粉酶酶解芡實淀粉的適宜溫度為50～60℃。

2.2.5 酶解時間

在淀粉質(zhì)量濃度為10g/100mL，α-淀粉酶用量250U/g，pH值6～7的條件下，于50℃水浴中酶解，分析酶解時間對芡實淀粉酶解過程的影響。

圖5 酶解時間對芡實淀粉水解程度的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on reducing sugar release from gorgon nut starch

由圖5可知，隨酶解時間的延長，酶解液中還原糖釋放率顯著增加(P＜0.05)。酶解60min后，隨酶解時間的繼續(xù)增加，還原糖釋放率增加緩慢。因此，分析認(rèn)為，α-淀粉酶水解芡實淀粉的酶解時間以60min較合適，此時酶解液中還原糖釋放率為72.68%。

2.3 芡實淀粉酶解條件優(yōu)化

表2 α-淀粉酶水解芡實淀粉的正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design and results for optimizing enzymatic hydrolysis of gorgon nut starch

在酶解條件單因素分析的基礎(chǔ)上，以還原糖釋放率為指標(biāo)，采用L16(4)5正交試驗設(shè)計，對α-淀粉酶水解芡實淀粉的條件進(jìn)行優(yōu)化，同時對各因素的主次關(guān)系進(jìn)行分析。因素水平設(shè)置表、試驗設(shè)計及試驗結(jié)果見表2。影響還原糖釋放率的因子主次順序為：D＞E＞C＞A＞B，即酶解溫度＞酶用量＞pH值＞酶解時間＞底物質(zhì)量濃度。pH值、酶解時間和底物質(zhì)量濃度的影響較小，主要原因與其正交試驗中的設(shè)置水平差異較小有關(guān)。表中最優(yōu)酶解條件為試驗號12(A3B4C2D1E3)，即酶用量350U/g，底物質(zhì)量濃度為11g/100mL，pH值為6，于50℃水浴中水解100min。在此條件下，芡實淀粉酶解液中還原糖釋放率為79.61%。該酶解條件中各參數(shù)水平適中，易于控制，可作為α-淀粉酶水解芡實淀粉的最優(yōu)工藝條件。

以還原糖釋放率(y)為指標(biāo)對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二項式逐步回歸，得到還原糖釋放率的回歸模型為：y=36.78+2.64B+12.17D－3.76D2+1.50AE(r=0.8810)。

表3 各因素與RSR的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between reducing sugar release from gorgon nut starch and hydrolysis parameters

由表3可知，在用α-淀粉酶水解芡實淀粉的過程中，底物質(zhì)量濃度、酶解溫度和酶解時間與酶用量交互作用與酶解液中還原糖釋放率呈正相關(guān)，與D2呈負(fù)相關(guān)。其中酶解時間與酶用量交互作用對還原糖釋放率的影響達(dá)極顯著水平(P＜0.01)，其次是溫度。體系pH值影響較小的主要原因與試驗中設(shè)置水平范圍較窄有關(guān)(pH 5～8)，并不表明該因素影響小。這一點在條件分析部分已有體現(xiàn)。

2.4 芡實淀粉體外消化模擬

圖6 淀粉模擬消化過程中還原糖釋放率變化Fig.6 Changes in reducing sugar release from gorgon nut starch and rice starch during in vitro simulated digestion

由圖6可知，兩種淀粉在模擬胃液中的還原糖釋放率遠(yuǎn)低于酶解過程。主要原因在于模擬胃液中不含淀粉酶，且pH1.5的酸性條件又不足以使淀粉發(fā)生明顯水解，所以釋放出的還原糖也就很低了。在最佳實驗條件，還原糖釋放率最高值在模擬消化20min時出現(xiàn)，此后還原糖釋放率雖有小幅波動，但變化很小。模擬消化過程中，芡實淀粉的還原糖釋放率低于米淀粉的，但差異不顯著(P＜0.05)，表明芡實淀粉較不易消化。

圖7 淀粉模擬消化過程中可溶性糖釋放率變化Fig.7 Changes in soluble sugar release from gorgon nut starch and rice starch during in vitro simulated digestion

圖7是模擬消化過程中，可溶性糖釋放率隨時間的變化趨勢，與還原糖釋放率變化基本一致，最高釋放率也出現(xiàn)在消化20min時，不同的是可溶性糖釋放率稍高于還原糖釋放率，且米淀粉顯著高于芡實淀粉(P＜0.05)。該結(jié)果進(jìn)一步印證了“芡實淀粉較米淀粉較不易消化”的結(jié)論。米淀粉和芡實淀粉同屬于小顆粒淀粉，造成芡實淀粉較低消化率的一個原因可能與芡實淀粉中殘余較多的植物多酚類物質(zhì)有關(guān)[21]。此類物質(zhì)可以與多糖、蛋白質(zhì)分子結(jié)合，從而影響其消化水解。

3 討 論

3.1 芡實淀粉的酶解特性

芡實淀粉的最優(yōu)酶解條件為：α-淀粉酶用量為350U/g、底物淀粉質(zhì)量濃度為10g/100mL，pH值為6，于50℃水浴中水解60～80min。在此條件下，酶解液中還原糖釋放率可達(dá)79.61%。回歸模型和相關(guān)性分析表明，在α-淀粉酶水解芡實淀粉的過程中，底物質(zhì)量濃度、酶解溫度和酶解時間與酶用量交互作用對酶解液中還原糖釋放率值呈正相關(guān)，與D2呈負(fù)相關(guān)。其中酶解時間與酶用量交互作用的影響達(dá)極顯著水平(P＜0.01)。

3.2 芡實淀粉體外消化模擬

體外消化模擬結(jié)果顯示，芡實淀粉在模擬胃液中的還原糖和可溶性糖釋放率均遠(yuǎn)低于酶解過程。主要原因在于模擬胃液中不含淀粉酶，且pH 1.5的酸性條件又不足以使淀粉發(fā)生明顯水解。

在相同的消化模擬體系中，芡實淀粉的還原糖和可溶性糖釋放率均低于米淀粉的，表明芡實淀粉較米淀粉較不易消化，原因可能與芡實淀粉中殘留的植物多酚類物質(zhì)有關(guān)，此類物質(zhì)可與淀粉分子結(jié)合，并影響其水解。

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Enzymatic Hydrolysis Properties andin vitroDigestion of Gorgon Nut (Euryale feroxSalisb.) Starch

ZHANG Cuan1，WEI Zhao-jun2，YUAN Huai-bo2，ZHANG Man1
(1.Department of Chemistry and Life Science, Chuzhou University, Chuzhou 239000, China；
2. School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

In order to explore the enzymatic hydrolysis properties of gorgon nut starch, the hydrolysis parameters of gorgon nut starch byα-amylase were optimized. The results showed that the optimal hydrolysis parameters wereα-amylase amount of 350 U/g, gorgon nut starch concentration of 10 g/100 mL, hydrolysis pH of 6, hydrolysis temperature of 50 ℃ and hydrolysis time of 60－80 min. Under these conditions, the reducing sugar release from gorgon nut starch was 79.61%. The simulated digestion in vitro showed that the release of reducing sugar and soluble sugar from gorgon nut starch was much lower than that in enzymatic hydrolysis system. Moreover, the digestibility was slightly lower than that of rice starch. Therefore, gorgon nut starch was easily hydrolyzed byα-amylase. The slightly lower digestibility of gorgon nut starch may be related to polyphenols in it.

gorgon nut starch；α-amylase；enzymatic hydrolysis；simulated digestion

TS231

A

1002-6630(2012)03-0023-05

2011-01-29

安徽省應(yīng)用化學(xué)省級重點學(xué)科建設(shè)項目(200802187C)；滁州市科技計劃項目(201057)

張汆(1970—)，女，副教授，博士，主要從事食品化學(xué)與營養(yǎng)學(xué)、膳食蛋白研究。E-mail：zhangchuan2005@126.com