熱激處理對花椰菜小孢子培養的影響

韓 笑，劉希玲，文正華

（1.天津市種子管理站，天津 300061；2.津南區農業技術推廣服務中心，天津 津南 300350；3.天津科潤農業科技股份有限公司蔬菜研究所，天津 300384）

1 前言

花椰菜為十字花科蕓薹屬甘藍的一個變種。目前，花椰菜商品種中大多數是F1雜交種，要使其整齊一致，就必須要求制種親本高度純合、穩定。常規的親本獲得途徑是通過自花授粉和定向選擇，需經6～8代，費時費工，且花椰菜多為自交不親和。運用小孢子培養技術可以快速獲得基因型純合的雙單倍體（DH）植株，加速育種進程，將品種培育年限縮短為3～4 a。

花椰菜小孢子的培養最早見于1992年，Duijs等首次報道了花椰菜小孢子的培養，2003年后我國也相繼有了成功的報道。但與其它蕓薹屬作物相比,花椰菜游離小孢子培養比較困難。

本研究對花椰菜小孢子進行熱激處理，期望提高小孢子胚胎的發生率，為育種工作服務。

2 材料與方法

2.1 材料

選擇天津科潤蔬菜研究所溫室內花椰菜，于3～4月份取蕾進行試驗。

2.2 方法

2.2.1 花蕾大小的選擇

選擇不同大小的花蕾，加一滴醋酸洋紅染液，壓片，于顯微鏡下觀察，確定蕾長與小孢子發育時期的關系。選擇單核靠邊期小孢子比例較大的花蕾進行試驗。

2.2.2 培養基配制

小孢子游離與清洗采用B5液體培養基 （表1），蔗糖濃度 13%，pH6.0，高壓蒸汽滅菌 15 min。小孢子培養采用NLN液體培養基（表2），蔗糖濃度13%，pH6.0，先用0.8μm孔徑濾膜抽濾，再在無菌條件下用0.22μm孔徑濾膜抽濾除菌。胚狀體的分化培養基采用MS固體培養基 （表3），蔗糖濃度3%，瓊脂0.7%，1 mg/L 6-BA+0.01NAA+0.02IAA，pH5.8。

表1 B5培養基配方

表2 NLN培養基配方

表3 MS基本培養基配方

2.2.3 小孢子游離

選擇小孢子處于單核靠邊期的花蕾（4.1～5.0 mm）100個，先用75%酒精消毒30 s，再用含2%有效氯的安替福民溶液（次氯酸鈉）表面消毒15 min，無菌水清洗3次，每次5 min。加入B5培養基，輕輕擠破花蕾游離出小孢子，用50μm孔徑的尼龍篩網過濾，濾液經1000 r/min離心3 min，棄上清液，加B5培養基懸浮沉淀，再重復離心操作兩次。第三次離心后，用NLN-13培養基懸浮，用血球計數板調整小孢子密度至（1～2）×105個/ml。分裝到直徑為6 cm的培養皿中，每皿3 ml，用parafilm封口膜密封培養皿。

2.2.4 游離小孢子培養與胚狀體培養

將培養皿放入32.5℃下黑暗處理24 h，然后轉移到25℃下暗培養，2～3 d后觀察統計胚狀體數目，出胚率用每個花蕾的胚狀體數目表示。等胚長到一定大小后，轉移到MS固體培養基中，在25℃自然光條件下繼續培養，誘導再生植株。

2.2.5 熱激處理對小孢子胚狀體發生的影響

以花椰菜為實驗材料，用25℃暗培養作為對照，采用32.5℃黑暗處理24 h和48 h；37℃處理24 h和48 h之后轉移到25℃下繼續培養，統計不同處理小孢子的出胚情況。

3 結果與分析

高溫熱激預處理是促進細胞對稱分裂、改變小孢子發育方向的主要條件。實驗結果表明（表4），在32.5℃下黑暗處理24 h胚狀體的誘導率最高，平均每蕾可達1.03個，明顯高于32.5℃下黑暗處理48 h；而未經高溫的25℃條件下及過高的37℃條件下未觀察到胚狀體的發生。

表4 不同熱激處理下的小孢子出胚率

4 討論

4.1 熱激處理對小孢子胚狀體發生的影響

高溫處理是改變小孢子發育途徑的必要條件，抑制配子體發育途徑，促使小孢子對稱分裂，向胚狀體方向發育，促進胚狀體的發生。未經熱激處理以及熱激處理溫度太高都不能改變其發育途徑，不能產生胚狀體。本次研究表明，32.5℃下黑暗處理24 h為最適條件。

4.2 花椰菜小孢子培養現存問題

影響小孢子胚狀體發生的因素有很多，本次實驗只針對熱激處理進行研究，對于取蕾前溫室氣溫、陽光以及植株的生長狀況等條件，由于時間原因都未進行研究。其它影響因素還有很多，還有待于進一步深入研究探索。

5 結論

熱激處理是改變小孢子發育途徑、促進胚狀體發生的重要環節，最適熱激條件為32.5℃下黑暗處理24 h。

［1］顧宏輝,唐桂香,張國慶,等.冬性花椰菜的小孢子胚誘導和植株再生研究[J].浙江大學學報,2004,30(1)∶34-38.

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