PPARα/γ雙重激動劑的設計及分子動力學研究

王業柳，馬 英，王潤玲，王樹青，徐為人

（1.天津醫科大學藥學院，天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室，天津300070；2.天津藥物研究院，天津市新藥設計與發現重點實驗室，天津300193）

糖尿病被列為繼心血管疾病及腫瘤之后的第三大疾病，目前全世界糖尿病患者中大部分是2型糖尿病，因此研究新型抗2型糖尿病藥迫在眉睫[1]。研究人員發現，過氧化物酶體增殖因子活化受體PPARs是一類配體調控的轉錄因子，有3種亞型：PPARα,PPAR γ,and PPARβ/δ。它們在治療肥胖、血脂異常、高血壓及胰島素抵抗等方面起著至關重要的作用，因此成為備受關注的降糖靶點[2]。激動PPARα或PPARγ雖能提高胰島素的敏感性，但單獨使用還是會產生如體質量增加、液體積聚和肺水腫等副作用。雙重受體激動劑不僅能促進代謝，還能減少單一受體激動劑所產生的副作用[3]，所以已經成為受人矚目的新型抗2型糖尿病藥。本研究旨在從drug-like數據庫中篩選出潛在的PPARα/γ雙重激動劑，并對其進行結構修飾從而設計出新的PPARα/γ雙重激動劑。

1 材料與方法

1.1 受體結構的準備 蛋白結構預處理由Schrodinger Suite 2009[Schrodinger（2009）.Schr dinger,LLC,New York]軟件中的Protein preparationwizard模塊完成。將下載的PPAR-α和γ靶點晶體結構（PDB ID:1k71和1k74）[4]導入SchrodingerSuite2009，首先對蛋白質結構進行修正，參數設定為Assign bond orders（修正化學鍵），Add hydrogens（加氫），Treatmetals（處理金屬離子），Cap terminiby adding ACE&NMA residues（修正N端和C端的殘基結構錯誤），經處理后除去蛋白質晶體結構中的水分子和雜原子，只保留蛋白分子與原始配體。再對蛋白質結構進行優化，氫鍵優化參數為Samplewaterorientations，優化力場選擇OPLS 2005[5]，以RMSD 0.5魡為收斂標準。以原始配體小分子GW409544為中心，大小為10魡×10魡×10魡生成對接盒子文件。盒子文件的選取對結果的正確性有很大的影響，所以本實驗以晶體庫中的PPAR γ（1k74）為例來驗證對接方法和盒子文件的選擇是否合理。把晶體結構中原始配體提取出來，對接到PPARγ（1k74）的配體結合區，再重新與晶體結構中的配體疊合比對。對接后的結構與配體原始結構的均方根偏差（RMSD）值為0.16魡。說明盒子文件能夠適用模擬體系。以下的實驗均采用這個盒子文件。

1.2 虛擬篩選 選取drug-like數據庫100 000個小分子作為虛擬篩選對象。配體優化是在LigPre模塊中完成的。小分子優化的力場為OPLS 2005，產生pH值7.0±2.0下的離子化狀態，去鹽，產生各種可能的互變異構體。將優化后的配體分別對入PPAR α/γ 的受體結合區，應用 Glide[6]模塊“HTVS”（高通量虛擬篩選）評估蛋白質和配體的結合能力。接著將得分排在前的1 000個化合物分別對入PPARα/γ的受體結合區，應用“SP”（標準精度）采用柔性對接，柔性對接時要求考慮各種環的柔性情況，要求對接函數在打分時對非平面型的酰胺鍵構象進行罰分，其它參數為默認值。

1.3 結構修飾 “Core Hopping”[CombiGlide2.5（2009）Schrodinger LLC]模塊具有替換片段和分子對接兩大功能，所以成為從頭藥物設計的新技術。在“Core Hopping”過程中，第一步是定義模板化合物。首先定義需要替換的片段，這一任務由Define Combinationsstep完成。第二步需要定義受體盒子，這部分已在Receptor Grid Generation中介紹。第三部分準備分子片段，分子片段來自于drug-like數據庫和ZINC數據庫中的片段數據庫。第四步把小分子片段連接到母核上，得到的結構對接到受體里。最后，依據對接得分進行篩選，得分的絕對值越大，配體與受體的親和力越強，結合力越好。

1.4 分子動力學模擬 利用Gromacs4.0軟件包將復合物放入正方體盒子中，加入簡單點電荷水分子（SPC），并加入抗衡離子，使模擬體系達到電中性，離子在模型中自動排布。模擬采用NVT系綜，使用v-rescale方法使系統溫度保持在300 K，范德華相互作用截斷半徑為1.4 nm，靜電相互作用采用PME算法。應用最陡下降法對所有體系進行1 000步能量優化。優化后，平衡體系：（1）限制重原子，等溫等容平衡水。（2）等溫等容平衡蛋白。（3）不限制任何原子，等溫等壓調整水盒子大小。（4）等溫等壓下進行10 ns非限制性分子動力學模擬。

1.5 ADME預測 Schrodinger Suite 2009軟件中的QikProp[QikProp3.2（2009）Schrodinger LLC]模塊可以預測化合物的吸收、分布、代謝、排泄性質。在QikProp模塊中，分子自動成中性狀態。在正常模式下，此模塊可以分析油水分配系數，水溶性，毒性。本實驗對 logPo/w、PSA、logS、PMDCK 進行預測。logPo/w指油水分布系數，改變藥物的油水分布系數達到提高其生物利用度的目的；logS指水溶性，改變藥物的水溶性提高藥物在血液中轉運速度；PSA指極化表面積，與膜滲透相關的另一個參數；PMDCK指狗腎細胞培養，與腸通透性有關的參數。

2 結果

2.1 PPARα/γ雙重激動劑模型 本實驗以ragalitazar一種新型的PPARα/γ雙重激動劑為陽性對照藥[7]。對接結果列于表1。從對接結果可以看出所設計的9個化合物結合能均強于ragalitazar。

表1 對接結果Tab 1 The resultsofdocking by Glide

圖1為comp#4 A-B2-C1和ragalitazar與PPAR α（1k71）和 PPAR γ(1k74)結合模式圖。由圖中可以看出comp#4A-B2-C1和ragalitazar的酸性頭部分與PPARα（或PPARγ）中的4個重要氨基酸殘基 Ser280/Ser289，Tyr314/His323，Tyr464/Tyr473和His440/His449形成氫鍵。這些氨基酸殘基與配體形成的氫鍵網絡可以使AF-2螺旋穩定于一種構象，從而使PPAR處于激活構象，實現基因表達的調控。新設計的化合物因有大的疏水部分C而與疏水臂II形成更強的疏水作用。這使化合物的結合力與ragalitazar相比增強。comp#4與PPARα（1k71）和PPARγ（1k74）的對接得分分別是-14.09和-13.15，比ragalitazar-11.49和-12.29高出兩個以上數量級。

2.2 虛擬篩選和結構修飾 通過對ZINC[8]數據庫中的drug-like數據庫進行虛擬篩選，得出ZINC06088083小分子與受體PPARα和PPARγ結合最好。ZINC06088083中的酸性頭能與AF2螺旋區的 Tyr464（1k71）和 Tyr473（1k74）形成氫鍵，使其穩定于激活構象。而ZINC06088083的缺點是與受體的疏水臂匹配性差，所以需要進一步的結構修飾。具體修飾過程如圖2所示：首先，在1H-pyrazole環上添加疏水分子片段以提高與受體的疏水臂的匹配性，找出3個優選片段C1、C2、C3；然后，對1H-pyrazole環進行替換旨在找到結合更強的片段，找出3個優選片段B1、B2、B3。這樣就產生了1×3×3=9個化合物。

2.3 分子動力學模擬結果 本實驗綜合結合模式和對接得分選出comp#4 A-B2-C1作為代表做動力學模擬。對PPAR空載、PPAR-ragalitazar和PPAR-comp#4的蛋白質骨架進行RMSD測算。如圖3所示PPARα/γ與comp#4很快達到了平衡狀態。分別穩定于0.18 ns，0.22 ns。為了更好地觀察受體結構的波動，對受體側鏈進行RMSF測算，結果如圖3所示。PPARα/γ與comp#4的AF-2螺旋區RMSF的波動和PPARα/γ與ragalitazar的波動有相似的波動趨勢，顯示出新化合物comp#4與ragalitazar有相似的結合AF-2螺旋的功能。

2.4 ADME預測結果 應用Schrodinger2009軟件包中的QikProp模塊對與藥效相關的5個性質進行預測。結果如表2所示。新設計的化合物的logPo/w、PSA、logS、PMDCK均在合理的范圍內。

表2 ADME預測Tab 2 Physiochem icaldescriptorscalculated by QP

3 討論

3.1 PPARα/γ雙重激動劑的設計 PPARs的天然配體是脂肪酸類化合物，因此，激動劑與PPARs的結合位點幾乎是疏水的。Y型受體結合區域的3個疏水臂產生的疏水作用是設計PPARs新激動劑的關鍵。PPAR受體結合區域由極性區、疏水區和親水區組成。AF-2螺旋在極性區內。PPAR激動劑的酸性頭與AF-2螺旋形成氫鍵，它的疏水尾與PPAR的疏水區和親水區結合。這種結合方式穩定了AF-2螺旋區域構象。通過與配體的結合降低了AF-2的電子遷移率促進了電子夾的形成，實現基因表達的調控[9]。靶點的選擇對化合物的設計起到至關重要的作用。從RCSB蛋白數據庫下載中選擇了PPARα和PPARγ兩個代表性的受體結構（PDB ID 1k71和 1k74），選擇這兩個蛋白的原因如下：（1）這兩個蛋白包含了相同的配體GW409544，它們與GW409544的結合力相似，但GW409544對PPARα受體的活性較弱。（2）這兩個蛋白是人源[10]。ragalitazar是一種高效高選擇性的PPARα/γ雙重激動劑,它引發的PPARα生物活性是PPARα激動劑（WY-14643）的0.97倍，引發PPARγ生物活性是PPARγ激動劑（羅格列酮）的1.17倍[11]。ragalitazar的酸性頭部分與PPARα（或PPARγ）中的4個重要氨基酸殘基Ser280/Ser289,Tyr314/His323,Tyr464/Tyr473和His440/His449形成氫鍵，起到激動受體的作用。由圖1可以看出comp#4與這4個重要氨基酸殘基也形成了氫鍵，而本實驗設計的化合物不僅能和這些關鍵殘基形成氫鍵，還能與受體的疏水區形成疏水作用。這是本實驗設計的化合物創新點所在。

3.2 PPARα/γ雙重激動劑的分子動力學研究 分子動力模擬是應用生化分子體系力場及根據牛頓運動力學原理所發展的計算方法。系統中的粒子的運動有正確的物理依據。本實驗比較了PPARα/γ與comp#4的AF-2螺旋區RMSF的波動和PPARα/γ與ragalitazar的波動，發現兩者的波動趨勢相近。進一步在理論上證明設計的化合物與已知的激動劑ragalitazar具有相似的功能。

3.3 ADME預測 現今，一個成功用作口服藥物的化合物必須具有足夠的水溶性以及和其臨床藥效相關的通透性。準確的ADME預測對進一步合成起到指導作用。本實驗設計的化合物logPo/w、PSA、logS、PMDCK均在合理的范圍內。盡管logPo/w越高，結合能力越強，但不能過度的增強logPo/w水平，這樣會導致藥物在體內分布較差[12]。從表1可以得出所設計的化合物可以作為新藥的目標化合物，為今后的研究奠定基礎。

[1]Shearer B G,Billin A N.The next generation of PPAR drugs:Do we have the tools to find them[J].Biochim Biophys Acta,2007,1771（8）:1082

[2]Bénardeau A,Benz J,Binggeli A,et al.Aleglitazar,a new,potent,and balanced dual PPAR α/γ agonist for the treatment of type II diabetes[J].BioorgMed Chem Lett,2009,19（9）:2468

[3]Berger JP,Akiyama T E,Meinke PT.PPARs:therapeutic targets formetabolic disease[J].Trends PharmacolSci,2005,26（5）:244

[4]Issemann I,Prince R A,Tugwood JD.etal.The peroxisome proliferator-activated receptor:retinoid X receptor heterodimer is activated by fatty acidsand fibratehypolipidaemic drugs[J].JMol Endocrinol,1993,11（1）:37

[5]Oostenbrink C,Soares TA,VanderVegtN F,etal.Validation of the 53A6GROMOS force field[J].Eur Biophys J,2005,34（4）:273

[6]Halgren T A,Murphy R B,Friesner R A,et al.Glide:a new approach for rapid,accurate docking and scoring.2.Enrichment factors in database screening[J].JMed Chem,2004,47（7）:1750

[7]Sauerberg P,Pettersson I,Jeppesen L,et al.Novel tricyclic-alpha-alky-loxyphenyl propionic acids:dual PPAR alpha/gamma agonistswithhypolipidemicandantidiabeticactivity[J].JMed Chem,2002,45（ 4）:789

[8]Irwin JJ,Shoichet B K.ZINC--a free database of commercially available compounds for virtual screening[J].JChem Inf Model,2005,45（1）:177

[9]JiCG,Zhang JZ.Protein polarization is critical to stabilizing AF-2 and helix-2′domains in ligand binding to PPAR-gamma[J].JAm Chem Soc,2008,130（50）:17129

[10]Xu H E,LambertM H,Montana V G,etal.Molecular recognition of fatty acidsby peroxisome proliferator activated receptors[J].Mol Cell,1999,3（3）:397

[11]Ebdrup S,Pettersson I,Rasmussen H B,et al.Synthesis and biologicaland structuralcharacterizarion of thedualacting peroxisome proliferatoractivated α/γ agonistragaglitazar[J].JMed Chem,2003,46（ 8）:1306

[12]Markt P,Schuster D,Kirchmair J,et al.Pharmacophoremodeling and parallel screening for PPAR ligands[J].JComput Aided Mol Des,2007,21（10/11）:575