山西省糯玉米自交系的遺傳多樣性分析及類群劃分

程宇坤，白建榮，張效梅，任 元，王秀紅

（1.山西大學生物工程學院，山西太原030006；2.山西省農業科學院作物科學研究所，山西太原030032；3.山西省農業科學院現代農業研究中心，山西太原030031；4.山西省農業科學院農作物品種資源研究所，山西太原030031）

糯玉米又叫黏玉米、蠟質玉米，其主要特點是籽粒中的淀粉全為支鏈淀粉。糯玉米具有許多優良特性，品質極佳。隨著人們生活水平的不斷提高，糯玉米作為鮮食玉米越來越受到人們的喜愛，并且其市場需求也越來越大。因此，糯玉米將是發展特色農業的良好資源。許多研究結果表明，糯玉米僅分布于亞洲東部，我國是糯玉米種質的起源地，且擁有非常豐富的糯玉米種質資源[1]，但我國糯玉米育種工作起步較晚。目前，糯玉米自交系多是將農家糯玉米品種通過雜交、回交等方法導入到普通玉米骨干系中，或者直接利用糯玉米雜交種選育而成，多數自交系無系譜可查，自交系間的親緣關系也并不清楚。最初的遺傳多樣性研究采用形態標記、系譜分析、配合力表型及同工酶等方法，但這些方法在進行遺傳變異分析時均存在不同程度的局限性，因此，嚴重限制了我國糯玉米育種工作的進一步突破。

近年來，SSR標記技術已被證明是分析種質資源多樣性并對其進行類群劃分的有效手段，并在玉米種質資源研究中得到廣泛利用和認可。借鑒對普通玉米自交系的研究方法，利用SSR標記技術研究糯玉米種質資源將有利于進一步在分子水平上確定糯玉米種質資源的利用價值。前人已經通過SSR標記對糯玉米遺傳多樣性和雜種優勢群的劃分進行了研究。王鵬文等[2-3]利用SSR標記分別分析了30，40個糯玉米自交系的遺傳多樣性。陳坤等[4]利用48份糯玉米自交系遺傳多樣性的SSR標記將糯玉米劃分為6類群，同時借助普通玉米自交系雜種優勢劃分的研究方法，利用SSR標記和適合的標準測驗種，可以有效地將不同來源的糯玉米自交系劃分到相應的種質類群中，對指導糯玉米育種有重要參考價值。研究表明，SSR標記應用于糯玉米遺傳多樣性分析和雜種優勢類群劃分的研究是可行的。

山西省地形復雜，形成了許多生態小氣候。山西省農科院農作物品種資源研究所經過多年培育，育成大量適合山西省當地生長的糯玉米自交系，到目前為止，還未從分子水平上對其進行遺傳闡釋，即揭示其遺傳多樣性、對其進行分類，并研究這些糯玉米自交系與我國現有的幾大玉米種質間的關系。本研究通過SSR標記技術分析山西省糯玉米自交系的遺傳多樣性，并進行雜種優勢類群的劃分，旨在為提高雜交組配的科學性、提高育種效率和育種水平，為糯玉米種質改良利用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料分為2大部分：（1）6份標準測驗種，包括黃早 4，Mo17，丹 340，B73，掖 478 和齊319，分別代表唐四平頭群、蘭卡斯特群（Lancaster）、旅大紅骨群、Reid 群、PA群、PB群；（2）52 份山西省常引用和自選的糯玉米自交系。

1.2 糯玉米DNA的提取

采用CTAB法提取葉片基因組DNA，每份材料提取10株。用蛋白核酸定量測定儀測量DNA的濃度和質量，并將DNA樣品質量濃度稀釋至20 ng/μL，-20℃保存備用。

1.3 引物選擇

采用建立國家玉米品種指紋庫的20對標準引物（引物1～20）作為基本核心引物[5]，按照擴增條帶清晰、多態性強、擴增帶型穩定、在染色體上均勻分布的原則篩選出來的20對引物（引物21～40）為輔助核心引物[6-10]，另外選取其他較好的引物9對（引物41～48）。

1.4 PCR擴增

擴增反應在美國BIORAD公司的PT100上進行。PCR反應體系為：反應總體積20μL，其中，2 μL10×PCR Buffer（含Mg2+），1 μL 2.5 mmol/L dNTPs，1 μL 10 μmol/L SSR 引物，0.1 μL Taq DNA聚合酶，4 μL DNA模板，剩余用ddH2O補全。PCR擴增程序為：95℃預變性5 min，1個循環；94℃變性1 min，55℃復性30 s，72℃延伸1 min，共35個循環；最后于72℃延伸10 min，放入4℃冰箱備用。

用6%聚丙烯酰胺變性凝膠進行擴增產物的電泳分析，恒定功率為60 W。凝膠通過固定、水洗、銀染、顯影等步驟完成染色并于室溫干燥。在白熾燈下觀察電泳結果，同時進行數據統計和掃描照相。

1.5 一致性檢測

將供試材料各隨機選取5株，用國家20對標準引物篩選進行一致性檢測。在每一個引物的譜帶上以多數單株（＞3株）有的帶型作為每一份材料的帶型。如果在每一份材料能找到20對引物都有確定帶型的單株，則將這些單株作為這份材料的代表株。如果用5株不能確定某個引物的帶型，則要擴大到10株。如果在某份材料不能找到20對引物都有確定帶型的單株，則這份材料將沒有代表株。

1.6 數據分析

SSR擴增帶型以0，1，9統計，建立數據庫。在相同遷移率位置上，有帶記為1，無帶記為0，缺失記為9。按Nei和Li的方法計算自交系間的遺傳相似系數：GGS＝2Nij/（Ni＋Nj）；遺傳距離：GGD＝1－GGS。其中，GGS為遺傳相似系數；Ni為 i品種出現的譜帶數；Nj為j品種出現的譜帶數；GGD為遺傳距離。按Smith等提供的公式計算多態性信息量（Polymorphism information content，PIC），即 PPIC＝1-∑fi2。按 UPGMA（Unweighted pair group method rithmetic averages）方法進行聚類分析。所有數據處理均由ntsys-pc 2.10e和Excel軟件完成。

2 結果與分析

2.1 SSR標記分析

本研究首先采用建立國家玉米品種指紋庫的20對標準引物對52份山西省常引用和自選的糯玉米自交系進行了一致性檢測，經大量、反復篩選，確定了山西省38份糯玉米自交系的DNA模板。然后用49對引物對6份標準測驗種和38份玉米自交系進行擴增。從表1可以看出，本研究所選用的覆蓋玉米全基因組的49對SSR引物在44份玉米自交系中均具有多態性，共檢測到294個等位基因，不同SSR位點所檢測到的等位基因為3～10個，平均每個位點6個。檢測到等位基因最多（10個）的位點是umc2163，檢測到等位基因最少（3個）的位點是phi076，umc1279，bnlg1940。44份玉米自交系的PIC平均為 0.633，變幅為 0.223～0.836。

表1 49對SSR引物在44份自交系中的等位變異情況及多態性信息量

特有基因指在標準種質中沒有且只有1個 供試自交系有的等位基因；稀有基因是指在標準種質中沒有且2個以上供試自交系有的等位基因。從表1還可以看出，共檢測到稀有等位基因86個，特有等位基因32個。在phi080這個位點上存在稀有等位基因最多（5個），bnlg1450和umc1018位點上存在的特有等位基因較多，均為3個。表2統計的是糯玉米自交系材料中含有特有和稀有等位基因的數量。

從表2可以看出，朱子糯、羅糯米含有特有等位基因數分別為5，4個；山黑M，3B含有稀有等位基因分別為18，17個。這說明山西省糯玉米自交系中含有較多的稀有和特有等位基因。

表2 38份糯玉米自交系中特有和稀有等位基因數

2.2 聚類分析

根據SSR數據得出，38份糯玉米自交系的遺傳相似系數在0.69～0.94之間。自交系丹340和 XN-1，05-34和 Mo17，05-774和 Mo17 之間的遺傳相似系數較小，為0.69；自交系L2與L4間遺傳相似系數為0.94，北珍和早M的遺傳相似系數為0.93。以SSR標記遺傳相似系數建立矩陣，利用ntsys-pc2.10e數據分析軟件，用UPGMA進行聚類分析，建立樹狀聚類圖（圖1）。在遺傳相似系數約為0.77時，44份自交系很明顯被分為8大類群。

從表3可以看出，各類群包括的自交系主要是：第1類群為以黃早4為代表的含有唐四平頭血緣的自交系，共6份；第2類群是山西群1，共1份；第3類群為以丹340為代表的旅大紅骨群，共8份；第4類群是以Mo17為代表的Lancaster群；第5類群為山西群2，共23份；第6類群是以B73為代表的Reid群；第7類群為以掖478為代表的PA群，共3份；第8類群為齊319的PB群（表3）。從表3還可以看出，沒有1份糯玉米自交系劃分在Lancaster群、Reid群和PB群中。

表3 44份糯玉米自交系的SSR標記聚類結果

3 討論

很多自交系雖然經過了多代選擇，在形態上趨于一致，但在遺傳上還存在異質性，嚴重影響統計數據的準確性。因此，本研究首先用20對標準引物進行試驗材料的一致性檢測，通過一致性檢測可以有效地避免上述問題出現，減少數據誤差。

糯玉米種質是受隱性突變基因（wxwx）控制的一個普通玉米突變類型。糯玉米種質與普通玉米的最大區別是糯與非糯的差異，即由該基因所控制的表型性狀的差異，而該基因位于第9染色體上。結果表明，本研究選用的分布于玉米的整個基因組的49對SSR引物在普通玉米自交系與糯玉米自交系中均檢測到等位變異的存在。這說明2類種質的遺傳差異不僅僅是限于該糯性基因位點，而是遍布整個基因組的。這進一步證明了SSR標記是鑒定糯玉米種質資源親緣關系的一條有效途徑。

劉雪[11]將70對SSR引物在44份地方品種中檢測到的等位基因數目和在12個標準自交系中檢測到的等位基因進行比較，發現在每個群體中都有一些在標準自交系中未能檢測到的稀有等位基因，在陜西省的白烏龍早群體中發現的稀有等位基因數最多（16個）。段運平等[12]在13份國內適應群體中發現，國內群體所特有的等位基因13個。本研究應用SSR技術分析山西省38份糯玉米自交系時發現，在每個材料上都能檢測到很多稀有等位基因，總共檢測出86個稀有等位基因；在16份材料中檢測到特有等位基因，共檢測出32個特有等位基因。這說明山西糯玉米自交系遺傳多樣性非常豐富，很多自交系具有頻率很高的獨特基因。可以初步認為，具有特異等位基因的這些自交系有可能作為山西省核心種質的標志，在一定程度上代表了山西糯玉米自交系的分子指紋特征。

所選用的 38份材料的遺傳相似系數在0.69～0.94之間，說明多數材料間具有一定的遺傳差異。山西糯玉米自交系分為5大類，其中，有2類明顯與普通玉米的6大類群不在一類，以玉F為首的一類中含有豐富的山西省本地糯玉米資源，這就為育種者提供了新的育種方向，可以培育Lancaster群、Reid群和PB群的糯玉米自交系，也可通過本地類與其他玉米優勢群系雜交培育新的雜交種。

綜上所述，SSR分子標記技術是在DNA水平上明晰糯玉米種質遺傳多樣性水平，并對其進行遺傳構成分析和類群劃分的有效手段。山西省糯玉米自交系遺傳多樣性非常豐富，有許多特有的等位基因，它們可能具有一定的特異性，對于拓寬種質的遺傳基礎可能會起很大的作用，應引起育種家的高度重視。而且，很多山西省糯玉米自交系構成了獨特的一個類群，有可能形成新的糯玉米雜優模式。

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