貴州省某豬場(chǎng)豬瘟病毒感染的診斷

羅險(xiǎn)峰，劉 建，湯德元，李春燕

（ 1.貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽(yáng) 550008；2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

豬 瘟(classic swine fever，CSF)是由豬瘟病毒（CSFV）引起的豬的—種急性、熱性和高度接觸傳染的病毒性傳染病。該病的臨床特征為發(fā)病豬高熱稽留、細(xì)小血管壁變性導(dǎo)致引起各器官組織的廣泛出血、脾梗死等[1-2]。CSF具有高度接觸傳染性，流行范圍廣，發(fā)病率和死亡率極高，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。CSF被OIE列為A類傳染病，我國(guó)也將其列為一類動(dòng)物傳染病。2012 年3月，貴州省某豬場(chǎng)共有存欄豬80頭，發(fā)病3 d共計(jì)死亡10頭。為了掌握該豬場(chǎng)疫病的感染狀況，對(duì)該豬場(chǎng)送檢的病料進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀觀察、解剖病理診斷、細(xì)菌學(xué)檢測(cè)和RT-PCR技術(shù)診斷，最終確診為豬瘟病毒感染。現(xiàn)將診斷結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

病料：貴州省某豬場(chǎng)送檢的發(fā)病豬血清10份，發(fā)病豬1頭。

1.2 主要試劑

鮮血瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基、瓊脂糖（均購(gòu)自上海陽(yáng)光生物技術(shù)有限公司）；豬瘟抗體金標(biāo)檢測(cè)卡（購(gòu)自深圳市康百得生物科技有限公司）；豬瘟病毒RT-PCR檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司）； DL 2000 DNA Marker（購(gòu)自大連寶生物工程有限公司）。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 流行病學(xué)調(diào)查 采用向畜主詢問(wèn)的方法，了解豬場(chǎng)發(fā)病狀況并記錄。

1.3.2 臨床癥狀及剖檢病理變化對(duì)該豬場(chǎng)送檢的發(fā)病豬進(jìn)行臨床觀察及剖檢病理變化觀察，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.3 快速金標(biāo)檢測(cè)卡檢測(cè)血清樣本 應(yīng)用豬瘟病毒抗體快速金標(biāo)檢測(cè)卡對(duì)送檢10份血清進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.4 細(xì)菌分離 剖檢送檢病豬后，無(wú)菌采集病變明顯的腎臟、肺臟、淋巴結(jié)和脾臟等組織器官，進(jìn)行直接觸片，分別進(jìn)行革蘭氏和瑞氏染色，鏡檢。同時(shí)將上述病料、關(guān)節(jié)積液和心血等無(wú)菌操作劃線接種在普通瓊脂平板培養(yǎng)基和鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h觀察。

1.3.5 RT-PCR檢測(cè) 按照豬瘟病毒RT-PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)處理上述收集的淋巴結(jié)、腎臟、脾臟、肺臟和肝臟等病料，然后提取病毒總RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。RT-PCR反應(yīng)體系：16.8μL RT-PCR反應(yīng)液(用前混勻)，1.2μL酶混合液，2μL模板RNA，總體積20μL。RT-PCR反應(yīng)條件：42 ℃ 45 min，95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病情況

該豬場(chǎng)共有存欄豬80頭，發(fā)病3天共計(jì)死亡10頭。發(fā)病豬出現(xiàn)了體表發(fā)紅，發(fā)熱、體溫升高到40.0～41.0 ℃、稽留不退，衰弱顫抖，病豬先便秘后腹瀉。體溫開(kāi)始升高時(shí)可見(jiàn)病豬便秘，先排出干燥糞球呈顆粒狀，后排出帶白色黏液、黏膜或膿血的深褐色糞球等疑似豬瘟癥狀。

2.2 臨床癥狀及剖檢病理變化檢測(cè)

臨床癥狀：送檢病豬被毛粗亂，消瘦，尾根和肛門(mén)附近被糞便污染，體溫升高(41 ℃左右)，眼角有膿性分泌物，精神抑郁，眼瞼水腫，兩眼有多量黏膿性分泌物，咳嗽、嘔吐、流涎，全身皮膚有明顯出血點(diǎn)、出血斑。

剖檢病理變化：心包液增多、心肌柔軟，腎臟、膀胱、脾臟、喉頭、會(huì)厭軟骨、膽囊、胃和大腸黏膜出血；脾臟明顯腫大，邊緣或尖端有出血性梗死灶；肝臟邊緣鈍厚、質(zhì)硬、切面結(jié)構(gòu)模糊；頜下、腸系膜及腹股溝等處淋巴結(jié)腫脹，充血或出血，外表顏色從深紅色到紫紅色，切面呈紅白相間的大理石樣。

2.3 快速金標(biāo)檢測(cè)卡檢測(cè)血清樣本

應(yīng)用豬瘟抗體快速金標(biāo)檢測(cè)卡對(duì)送檢的10份發(fā)病豬血清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果10份送檢血清在檢測(cè)線區(qū)（T）及對(duì)照線區(qū)（C）同時(shí)出現(xiàn)了紫紅色線（圖1），而且檢測(cè)線區(qū)（T）顏色較深，這表明豬體內(nèi)的豬瘟抗體滴度很高。

2.4 細(xì)菌分離

將肝、肺、脾、腎、淋巴結(jié)等組織觸片，進(jìn)行革蘭氏和瑞氏染色后，在光鏡下未見(jiàn)有特征性的細(xì)菌生長(zhǎng)，普通瓊脂培養(yǎng)基和鮮血瓊脂培養(yǎng)基上也沒(méi)有觀察到細(xì)菌生長(zhǎng)，這表明該病例并非細(xì)菌感染所致。

2.5 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

剖檢送檢病豬取其淋巴結(jié)、肝臟、腎臟、脾臟和扁桃體等病變組織20 g，按病料與PBS液體積比1∶5加入PBS研磨制成懸液，然后按照豬瘟RT-PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒總RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)了CSFV陽(yáng)性條帶，大小為272 bp，與CSFV陽(yáng)性對(duì)照條帶一致，這說(shuō)明送檢的病料中存在CSFV。結(jié)果見(jiàn)圖2。

3 討論與分析

1)通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀觀察、剖檢病理診斷及豬瘟抗體快速金標(biāo)檢測(cè)卡檢測(cè)，初步診斷該豬場(chǎng)斷奶仔豬疑似豬瘟病毒感染。通過(guò)對(duì)發(fā)病豬的淋巴結(jié)、腎臟、脾臟、肺臟和肝臟等組織進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌感染的存在。RT-PCR結(jié)果顯示，送檢病豬中檢出了CSFV核酸陽(yáng)性條帶，表明該豬場(chǎng)已經(jīng)感染了CSFV野毒。

2）近年來(lái)豬場(chǎng)的疾病情況日趨復(fù)雜，病毒性疫病的雙重感染、三重感染、細(xì)菌和多重病毒感染的現(xiàn)象越來(lái)越普遍，豬場(chǎng)的發(fā)病死亡率越來(lái)越高[4]。本次檢測(cè)結(jié)果表明，該豬場(chǎng)僅為豬瘟病毒單一感染。因此，建議該豬場(chǎng)緊急接種豬瘟病毒疫苗，將可疑豬和病豬全部隔離飼養(yǎng)，病死豬及污染物則徹底焚燒或深埋，對(duì)污染的圈舍和四周環(huán)境進(jìn)行嚴(yán)格消毒，患病豬群則帶豬消毒，同時(shí)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理并合理投喂抗生素避免其他疫病的繼發(fā)感染。

3）抗體快速金標(biāo)檢測(cè)卡和PCR方法在豬場(chǎng)疫病檢測(cè)中的聯(lián)合應(yīng)用，不僅實(shí)現(xiàn)了血清學(xué)抗體檢測(cè)，同時(shí)根據(jù)血清學(xué)抗體檢測(cè)結(jié)果，再進(jìn)行PCR檢測(cè)，避免了對(duì)病原的盲目判斷，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)疫病感染狀況的快速診斷。

[1]殷震,劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].2版.北京:科學(xué)出版社,1997：652-664.

[2]蔡寶祥.家畜傳染病學(xué)[M].4版.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2001：201-206.

[3]Edwards S, Fukusho A, Lefevre P C, et al. Classical swine fever: the global situation[J].Vet Microbiol，2000，13（73）:103-119.

[4]梁大明,陸紅梅,高婕,等.淺析我國(guó)豬病流行現(xiàn)狀及應(yīng)對(duì)策略[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2007,34(1):160-161.