利用ITS基因研究徐聞濱珊瑚的系統發生關系

李文娟, 劉楚吾, 劉 麗, 廖寶林

(1. 廣東海洋大學 水產學院 , 南海水產經濟動物增養殖廣東省普通高校重點實驗室, 廣東 湛江 524025;2. 徐聞珊瑚礁國家級自然保護區, 廣東 湛江 524100)

利用ITS基因研究徐聞濱珊瑚的系統發生關系

李文娟1, 劉楚吾1, 劉 麗1, 廖寶林2

(1. 廣東海洋大學 水產學院 , 南海水產經濟動物增養殖廣東省普通高校重點實驗室, 廣東 湛江 524025;2. 徐聞珊瑚礁國家級自然保護區, 廣東 湛江 524100)

分別研究了徐聞3種濱珊瑚的ITS1和ITS2基因的堿基組成和G+C含量, 并和已上傳至Genbank上的其他9種濱珊瑚的ITS序列進行比較, 研究了徐聞3種濱珊瑚的系統發生關系。序列分析結果顯示, 3種濱珊瑚的ITS1的長度為205 bp～209 bp, G+C含量為37.6%～45.5%, ITS2的長度為192 bp～226 bp,G+C含量為45.1%～50.7%, 利用MEGA4.1軟件計算濱珊瑚屬基于ITS1和ITS2基因的平均遺傳距離分別為0.097和0.200。基于ITS1和ITS2的NJ系統進化樹都顯示出, 灰黑濱珊瑚位于進化樹的基部,是原始的類群, 普格濱珊瑚是進化類群, 澄黃濱珊瑚是過渡類群。

濱珊瑚; ITS基因; 系統發生關系

濱珊瑚屬(Porites link)屬刺細胞動物門(Cnidaria), 六放珊瑚亞綱(Anthozoa), 石珊瑚目(Scleractinia), 濱珊瑚科(Poritidae Gray)。濱珊瑚屬的珊瑚都是群體, 主要由外觸手芽形成群體, 珊瑚群體小, 珊瑚之間有少量的共骨緊密相連[1]。濱珊瑚在生長的時候, 骨骼中的碳酸鈣在積聚時會因環境的影響而有不同的密度, 因此濱珊瑚屬可提供關于過去的氣候資料[2], 全球氣候變化使濱珊瑚面臨嚴峻的考驗, 珊瑚礁白化的加劇迫使人們研究它們的系統發育關系。傳統的石珊瑚分類依據于骨骼, 但是由于石珊瑚具有形態可塑性, 傳統的分類方法具有一定的局限性, 往往存在同種異名的現象, 例如在香港海域找到的澄黃濱珊瑚和團塊濱珊瑚[1]就曾被認為是同一種。

ITS(Internal Transcribed Spacer)基因, 即內轉錄間隔區, 由于所受的選擇壓力較小、DNA堿基替換速率較快, 加上較大的拷貝數、適中的長度和快速的同步化等特點, 變異速度較快, 可以提供豐富的變異位點和信息位點[3], 所以經常被用于低等真核生物, 研究屬水平種間關系。在石珊瑚中, 除了鹿角珊瑚, 都可以用 ITS基因研究種間的系統發生關系[4], Sanchez 等[5]、McFadden 等[6-8]、Forsman 等[9]分別用 ITS基因研究八放珊瑚和石珊瑚的系統發生關系, 本文以濱珊瑚屬的普哥濱珊瑚(Porites pukoensi), 灰黑濱珊瑚(Porites nigrescens)和澄黃濱珊瑚(Porites lutea)為研究對象, 研究徐聞3種濱珊瑚的系統發生關系, 以確定徐聞3種濱珊瑚種間關系。通過PCR擴增獲得ITS序列, 利用MEGA4.1軟件對所得 ITS序列進行比較分析, 鄰近法(NJ )構建濱珊瑚屬的系統發育樹。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗樣本

3種濱珊瑚樣品采自廣東省徐聞珊瑚礁國家級自然保護區, 純酒精固定, -20℃保存備用。

1.1.2 試劑

dNTPs; PCR 緩沖液; Taq酶均購自 Takara 公司(大連), 引物由上海生工工程技術服務有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的制備

參照盧圣棟[10]的方法提取基因組 DNA, 4℃低溫保存備用。

1.2.2 目的片段的PCR擴增和序列測定

所用的引物為六放珊瑚 ITS基因通用引物[11],PCR反應體系是25 μL, 內含 10×Buffer(含 mg2+)2.5 μL, dNTPs 2 μL,引物各 1 μL, rTaqDNA 聚合酶 2.5 U,總DNA約100 ng。擴增條件為： 95℃預變性4 min,94℃變性30 s, 50℃退火30 s, 72℃延伸2 min, 循環4次, 然后94℃變性30 s, 56 ℃ 3 0 s, 72℃延伸2 min, 30個循環, 最后72℃總延伸10 min。1%瓊脂糖電泳檢測, PCR產物直接由北京六合華大基因科技股份有限公司進行雙向測序。

1.2.3 數據分析

采用 MEGA 4.1(molecular evolution genetic analysis, Version 4.1)鄰近法(NJ ) Bootstrap重復檢測2000次構建基于濱珊瑚的ITS1和ITS2基因的系統發育樹,空位(gap)始終作為缺失狀態, 并計算濱珊瑚屬種間的遺傳距離。

2 結果

2.1 基于 ITS1基因的濱珊瑚屬種間遺傳距離分析和聚類分析

通過Krima2-Paramenter模式計算得到遺傳距離矩陣(表1), 用采用MEGA4.1軟件包對測序的3種濱珊瑚ITS1與GenBank的其他9種濱珊瑚ITS1進行對位排序后做NJ聚類分析, 用kimura雙參數法計算上述12種濱珊瑚個體之間的遺傳距離, 其中濱珊瑚各種ITS1基因之間遺傳距離為0.011～0.231, 它們的平均遺傳距離是0.097。NJ聚類樹上分為3支, 徐聞3種濱珊瑚分別位于進化樹的不同分支上, 基于ITS1基因研究徐聞 3種濱珊瑚系統關系時, 灰黑濱珊瑚處于底部原始的位置, 較其他 2種珊瑚親緣關系較遠, 澄黃珊瑚是過渡種, 普格濱珊瑚處于進化樹的上端(圖1)。

2.2 基于ITS2基因的濱珊瑚種間遺傳距離分析和聚類分析

對測序3種濱珊瑚的ITS2基因與GenBank的其他9種濱珊瑚ITS2進行對位排序后做NJ聚類分析,用kimura雙參數法計算上述12種濱珊瑚之間的遺傳距離(表 2)。ITS2基因的遺傳距離為 0～0.489, 平均遺傳距離是0.200。基于ITS2基因的NJ樹顯示徐聞的 3種濱珊瑚分別位于樹的兩大分支上, 灰黑濱珊瑚單獨作為一支位于進化樹的基部, 澄黃濱珊瑚處于過渡位置, 普格濱珊瑚處于系統進化樹的大分支上, 并且與柱狀濱珊瑚和扁縮濱珊瑚聚為一支(圖 2)。

表1 基于ITS1基因的濱珊瑚屬種間遺傳距離Tab. 1 Genetic distance among Porites Link according to ITS1 gene

3 討論

隨著環境的變化, 濱珊瑚已經成為徐聞珊瑚礁國家級保護區內的一大優勢種, 明確濱珊瑚屬內各種間的遺傳關系和分類地位對于研究整個珊瑚礁生態是舉足輕重的。本研究分別用 ITS1和ITS2基因研究了徐聞3種濱珊瑚屬的系統發生關系。

圖1 基于Kimura雙參數模型用檢測到的濱珊瑚ITS1序列構建的NJ樹Fig. 1 Neighbor-joining tree topology constructed on Kimura two-parameter distance matrix using ITS1 entire region in Porites Link

表2 基于ITS2基因的濱珊瑚屬種間遺傳距離Tab. 2 Genetic distance among Porites Link according to ITS2 gene

圖2 基于Kimura雙參數模型用檢測到的濱珊瑚ITS2序列構建的NJ樹Fig. 2 Neighbor-joining tree topology constructed on Kimura two-parameter distance matrix using ITS2 entire region in Porites Link

Nu-Wei[12]和 Chen[13]分別利用 ITS基因研究了鹿角珊瑚屬的系統發生關系, 認為ITS1基因不能用于種間或者種群間的系統進化分析, 而采用ITS2基因研究了鹿角珊瑚屬的系統發生。ITS2已經廣泛應用于植物[14-15]、動物[16]、真菌[17-18]的分類研究中。本實驗研究結果顯示基于ITS1得到的系統進化樹和基于ITS2的系統進化樹一致, 能夠反映出濱珊瑚各種之間的親緣關系和系統進化關系。全球珊瑚的分布有太平洋-印度洋區系以及大西洋-加勒比海區系,無論基于 ITS1還是基于 ITS2基因的研究結果都表明, 這兩個區系的珊瑚在基因距離上不存在明顯差異。從得到進化樹上來看, 太平洋-印度洋區系的疣濱珊瑚(Porites annae)和大西洋-加勒比海區系的Porites evermanni位于進化樹的一支上, 太平洋-印度洋區系火焰濱珊瑚和大西洋-加勒比海區系Porites rus Porites monticulosa也始終位于進化樹的一支上。

濱珊瑚的形態受環境影響較大, 同種珊瑚在不同的環境下, 骨骼的發育會發生很大的變化[19-21],依據于形態的濱珊瑚的分類存在著很大的不足。在形態學上, 濱珊瑚的群體形狀, 有塊狀和分枝狀的。在形態進化上認為分枝狀的要比塊狀的復雜。在用ITS2基因分析濱珊瑚屬時, 塊狀的扁縮濱珊瑚(Porites compressa)沒有和其他的塊狀濱珊瑚聚在一支, 而是和群體分枝狀的濱珊瑚聚在一起。Verril將Porites monticulosa和Porites rus和濱珊瑚科的另一個單種屬Stylaraea作為濱珊瑚屬的一個亞屬[22], 而本文分別用ITS1和ITS2研究了Porites monticulosa和 Porites rus的分類地位, Porites monticulosa和Porites rus始終聚在一起, 表示這兩個種在濱珊瑚屬中親緣關系較近, 遺傳距離計算結果表明 Porites monticulosa和Porites annae的遺傳距離只有0.033,Porites rus和 Porites annae的的遺傳距離也只有0.033, 所以, Porites monticulosa和 Porites rus還不足以作為濱珊瑚的一個亞屬。

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Phylogeny analysis of Porites link in Xuwen using its gene

LI Wen-juan1, LIU Chu-wu1, LIU Li1, LIAO Bao-lin2
(1. Fisheries College, Guangdong Ocean University, Key Laboratory of Aquaculture in South China Sea for Aquatic Economic Animal, Regular High Education Institution of Guangdong Province, Zhanjiang 524025,China; 2. Xuwen National Coral Reef Nature Reserve, Zhanjiang 524100, China)

Nov.,11, 2011

porites; ITS genes; phylogeny

The obtained ITS (internal transcribed spacer) sequences of 3 species in Porites by PCR technique were analyzed by MEGA4.1 software to get base composition, G+C content and phylogenetic relationship with ITS gene of other 9 species uploaded to Genbank, The results showed that the ranges of ITS1 and ITS2 of the tested 3 species were 205～209 bp and 197～226 bp, and the ranges of G+C content of ITS1 and ITS2 were 37.6%～45.5% and 45.1%～50.7%. The average genetic distance based on ITS1 and ITS2 were 0.097 and 0.200 respectively .The NJ-based phylogenetic tree based both ITS1 and ITS2 shows that Porites nigrescens at the base of evolutionary tree,is a primitive group, Porites pukoensis is an evolutionary group and Porites lutea is a transitional group.

Q959

A

1000-3096(2012)07-0056-05

2011-11-11;

2012-01-22

廣東省海洋漁業科技推廣專項(A200908F01); 國家海洋公益性行業科研專項(201105012)

李文娟(1986-), 女, 安徽亳州人, 碩士研究生, 研究方向：海洋水產動物發育生物學, E-mail： liwenjuan8551@163.com; 劉麗, 通信作者, 副教授, 主要從事水產經濟動物發育生物學研究, E-mail：zjouliuli@163.com

(本文編輯：梁德海)