氣相色譜法分析小球藻脂肪酸的組成

鄭雪紅, 鄭愛榕

(廈門大學 海洋學系, 福建 廈門 361005)

氣相色譜法分析小球藻脂肪酸的組成

鄭雪紅, 鄭愛榕

(廈門大學 海洋學系, 福建 廈門 361005)

利用超聲波破碎技術在1 mol/L HCl-CH3OH溶液中提取小球藻脂肪酸并酯化, 并用氣相色譜和氣質聯用儀對其進行定量和定性分析, 鑒定出 C14：0, C16：2, C16：1, C16：0, C18：2, C18：1, C18：3, C18：0,C20：0共 9種脂肪酸, 其中不飽和脂肪酸占總脂肪酸的 65%。6份平行樣的相對標準偏差為 6.04%～9.84%, 樣品加標回收率范圍為77.0%～122.6%, 各種脂肪酸甲酯的儀器檢測限＜0.3 ng。初步探討了脂肪酸甲酯在弱極性色譜柱上的保留時間規律。

小球藻; 脂肪酸; 氣相色譜; 氣質聯用儀; 保留時間

海藻中含有大量有益于人體健康的生物活性物質, 其中的不飽和脂肪酸具有抗癌、抗菌、預防心血管疾病、養顏、健腦益智等功效[1-5], 可以增加動物成活率和生長率, 被廣泛應用于水產飼料添加劑[6-7]。同時, 海藻脂肪酸可以作為藻類的分類依據[8]、生物地球化學循環研究的生物標志物[9]及生物柴油的原料[10]。目前, 很多學者開展了海藻脂肪酸研究[11-14],樣品前處理方法一般依次為皂化、酸化、萃取分離、濃縮、甲酯化、萃取分離、濃縮, 操作步驟多, 耗時長; 儀器分析多采用氣相色譜或氣質聯用儀中的一種方法進行定性和定量, 但實際上, 海藻中含有的脂肪酸種類非常復雜, 對于一些相同碳數的各種不飽和脂肪酸, 在色譜柱上的保留時間非常相近甚至重疊, 在定性時易出現誤判。氣質聯用儀的長處在于提供豐富的離子碎片信息有利于定性, 但定量的準確性不如氣相色譜。所以, 本文以我國近海常見的微藻種群之一小球藻為研究對象, 采用超聲波破碎、在HCl-CH3OH溶液中提取脂肪酸并酯化, 免去皂化、酸化逐步進行的操作, 減少分離、濃縮的次數, 分別用氣相色譜和氣質聯用儀進行定量和定性分析, 探討前處理步驟簡化后方法的可行性, 歸納出脂肪酸甲酯的保留時間規律, 便于相同碳數脂肪酸相似組分的判定, 旨為海藻的開發利用研究提供更加簡捷的分析手段與色譜分析的基礎數據。

1 實驗儀器、材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

6890N氣相色譜儀(美國安捷倫公司); Saturn 2200 氣質聯用儀(美國瓦里安公司); SGD-300 氮、氫和空發生器(北京市精華苑技術研究所); 數顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司); 超聲波清洗器(上海超聲波儀器廠)。

飽和脂肪酸標準為國產分析純試劑, 不飽和脂肪酸標準為美國Fluka公司色譜純試劑, 甲醇和正己烷均為色譜純。

1.2 生物樣品

海水經過濾滅菌, 添加f/2培養基及小球藻藻種,在自然光下培養。通過離心、洗滌、干燥、研磨, 獲得小球藻藻粉, 密封冷藏保存。

1.3 脂肪酸甲酯的制備

稱取約10 mg小球藻于水解管中, 加入62.4 μg正十九烷酸內標, 加入2 mL 1mol/L HCl-CH3OH溶液, 充氮氣1min后密封, 超聲破碎 5 min, 然后在100 ℃水浴中抽提甲酯化40 min, 冷卻后用3 mL正己烷分3次萃取。合并提取液并用氮氣濃縮至1 mL,封口, 在冰箱中冷凍保存。按上述方法將脂肪酸標準衍生為脂肪酸甲酯。所有樣品分別用氣相色譜和氣質聯用儀分析。

1.4 氣相色譜分析條件

進樣口溫度280 , ℃不分流進樣, 進樣量1 μL, 采用 HP-5毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm), 載氣高純氮, 流量為1 mL/min, FID檢測器溫度為300 , ℃尾吹氮氣、氫氣和空氣流量分別為25、30和400 mL/min。升溫程序為： 在120 ℃恒溫1 min, 以20 /min℃升到210 , ℃恒溫10 min, 以6 /min℃升到250 , ℃恒溫3 min, 以30 /min℃升到280 , ℃恒溫6 min。

1.5 氣質聯用儀分析條件

進樣口溫度、進樣模式、進樣量、載氣流量、升溫程序同氣相色譜分析條件, 采用與HP-5極性等同的 VF-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm), 載氣高純氦, 傳輸線溫度280, ℃離子阱溫度180, ℃用電子轟擊 EI-Auto電離模式分析, 電子轟擊能量70 eV, 質荷比掃描范圍40～650。

1.6 定性和定量方法

以正十九烷酸為內標, 采用色譜相對保留時間和質譜定性, 利用相對校正因子按內標法定量。每種脂肪酸的含量用質量比(mg/g, 干質量)表示。

2 結果與討論

2.1 小球藻脂肪酸組成

各種脂肪酸甲酯的相對保留時間及相對校正因子如表1所示。圖1是標準脂肪酸甲酯和小球藻脂肪酸甲酯的氣相色譜圖, 有兩組脂肪酸甲酯共餾出,分別是 C18：1 和 C18：3、C20：1 和 C20：3, 其他脂肪酸甲酯得到較好的分離。通過質譜鑒定(圖 2), 發現小球藻中含有順-9,12-十六碳二烯酸(C16：2)。

小球藻脂肪酸的組成及含量見表 2, 共鑒定出C14：0, C16：2, C16：1, C16：0, C18：2, C18：1、C18：3,C18：0, C20：0共9種脂肪酸, 其中不飽和脂肪酸占總脂肪酸的 65%, 飽和脂肪酸以 C16：0和 C20：0為主,這與[15,16]的研究結果相似。本實驗、程遠月等[16]及Georgi和Guillermo[17]均未在小球藻中檢測到C20及C22系列的不飽和脂肪酸, 而廖啟斌等[18]和王明清等[12]報道小球藻中 C20：5含量高達 26.3%和 27.3%,呂冬偉等[14]的研究表明 C20：5含量為 13%, 這可能與微藻培養條件的差異有關, 或是小球藻受到其他藻種、細菌的影響[17]。

表1 脂肪酸甲酯的相對保留時間(RRT)、相對校正因子(RRF)及儀器檢測限Tab. 1 Relative retention time (RRT), relative rectification factor (RRF) and limit of detection for instrument of fatty acid methyl esters

圖1 標準脂肪酸甲酯(a)和小球藻脂肪酸甲酯(b)的氣相色譜圖Fig. 1 Gas chromatograms of fatty acid methyl esters for standard (a) and algae Chlorella (b)(1. C14：0, 2. C16：1, 3. C16：0, 4. C18：2, 5. C18：1+C18：3, 6. C18：1trans, 7. C18：0,8. C19：0, 9. C20：4,10. C20：5, 11. C20：1+C20：3, 12. C20：1trans, 13. C20：0, 14. C22：6,15. C22：1, 16. C22：0, 17. C24：1,18. C24：0, 19. C16：2)

圖2 小球藻中順-9,12-十六碳二烯酸甲酯(C16：2)質譜圖Fig. 2 Mass spectrum of cis-9,12-hexadecadienoic acid methyl ester in algae Chlorella

表2 小球藻脂肪酸組成Tab. 2 Composition of fatty acids in algae Chlorella

2.2 儀器檢測限

脂肪酸甲酯標樣稀釋后用氣相色譜分析, 計算3倍信噪比時的標樣質量, 得到的儀器檢測限如表 1所示, 各種脂肪酸甲酯的檢測限為 0.02～0.29 ng,

說明儀器具有很好的靈敏度。

2.3 儀器精密度

取一份經抽提并甲酯化衍生的小球藻樣品, 在氣相色譜上重復進樣 6次, 各組分的相對標準偏差(RSD)在 0.29%～5.34%之間(表 3), 說明儀器的精密度良好。

2.4 方法精密度

對同一小球藻樣品, 平行稱取6份, 經抽提甲酯化后用氣相色譜分析, 其結果如表4所示。6份平行樣品中各種脂肪酸甲酯的RSD為6.04%～9.84%, 說明方法的精密度良好。

2.5 加標回收率

稱取約10mg藻粉3份, 分別加入低、中、高三種質量水平的各種脂肪酸標準, 經抽提甲酯化后用氣相色譜分析, 其回收率范圍分別為 77.0%～111.7%、78.8%～116.8%、86.9%～122.6%(表5), 說明該方法的回收率較好。

2.6 脂肪酸甲酯的保留時間規律

從表1可以看出, 脂肪酸甲酯在HP-5這種弱極性柱上的保留時間規律為： (1)保留時間與脂肪酸的碳數成正比, 即碳數越大, 保留時間越長; (2)從C18、C20和C22系列脂肪酸甲酯的相對保留時間可以看出, 對于相同碳數的各種脂肪酸甲酯, 飽和脂肪酸最后出峰, 雙鍵數目越多, 保留時間越短, 同時雙鍵數目為偶數的脂肪酸甲酯早于雙鍵數目為奇數的脂肪酸甲酯出峰; (3)同一種脂肪酸甲酯, 順式脂肪酸甲酯先出峰, 反式脂肪酸甲酯后出峰。根據上述

規律, 有利于在標準品種類不足或缺乏質譜定性時對脂肪酸組分進行推斷。

表3 重復6次進樣的分析結果(mg/g, 干質量)Tab. 3 Results of six injections for one sample (mg/g, dry weight)

表4 小球藻平行樣測定結果(mg/g, 干質量)Tab. 4 Results of six parallel samples for algae Chlorella (mg/g, dry weight)

表5 小球藻樣品加標回收率結果Tab. 5 Recoveries for spiked standards in samples

3 結論

建立了小球藻脂肪酸超聲波破碎、抽提與甲酯化同時進行的前處理方法及氣相色譜、氣質聯用儀的分析方法, 大部分脂肪酸甲酯得到較好的分離并經過質譜準確定性。各種脂肪酸甲酯的儀器檢測限均小于 0.3ng, 實際樣品的相對標準偏差為 6.04%～9.84%, 加標回收率77.0%～122.6%, 具有簡便、快速、靈敏等特點, 可滿足實際應用的需要。實驗推斷出的脂肪酸甲酯保留時間規律, 為脂肪酸的色譜分析提供了基礎數據。

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Determination of fatty acids in algae Chlorella by gas chromatography

ZHENG Xue-hong, ZHENG Ai-rong
(Department of Oceanography, Xiamen University, Xiamen 361005, China)

Mar.,1,2012

Algae Chlorella; Fatty acids; Gas chromatography; Gas chromatography/mass spectrometry; Retention time

A shortcut method to analyze fatty acids in marine algae quickly and easily was reported in the paper.The ultrasonic extraction was used in the pretreatment of algae Chlorella, then the fatty acids were converted to fatty acid methyl esters by 1 mol/L HCl-CH3OH. The composition of fatty acid methyl esters was analyzed with gas chromatography and gas chromatography/mass spectrometry. Nine fatty acids including C14：0, C16：2, C16：1,C16：0, C18：2, C18：1, C18：3, C18：0, C20：0 were found and the unsaturated fatty acids was 65% of total. The relative standard deviations of six parallel samples were 6.04%～9.84%. The recoveries for spiked standards in samples were 77.0%～122.6%. The limits of detection for instrument were below 0.3 ng. The rule of retention time for fatty acid methyl ester was investigated. This method is very simple, quick and accurate and could be used in practical application.

0657.71; P734.5

A

1000-3096(2012)06-0022-06

2012-03-01;

2012-03-20

國家教育部高等學校骨干教師計劃基金資助項目; 廈門大學預研基金資助項目(B類 2003xdyy40); 國家海洋局公益性項目(201005012)

鄭雪紅(1977-), 福建龍巖人, 工程師, 研究方向： 從事海洋化學領域研究及色譜儀的功能開發, 電話： 0592-2186493 , E-mail：xhzheng@xmu.edu.cn

(本文編輯：康亦兼)