牙鲆與夏鲆雜交及回交子代胚胎發育及早期生長比較

隋 娟, 徐世宏, 王文琪, 馬道遠, 肖志忠, 肖永雙, 劉清華, 李 軍

(1. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 青島農業大學 動物科技學院, 山東 青島 266109)

牙鲆與夏鲆雜交及回交子代胚胎發育及早期生長比較

隋 娟1, 徐世宏1, 王文琪2, 馬道遠1, 肖志忠1, 肖永雙1, 劉清華1, 李 軍1

(1. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 青島農業大學 動物科技學院, 山東 青島 266109)

通過人工授精技術對牙鲆(Paralichthys olivaceus )和夏鲆( Paralichthys dentatus )進行了正反交及回交實驗, 并比較了正反交、回交子代的胚胎發育時序和仔稚幼魚的生長。結果表明： 孵化水溫18.0±0.5℃下, 初孵仔魚破膜用時為： 牙鲆41 h, 正交鲆 47 h, 回交牙鲆42 h30 min, 回交夏鲆 44 h;16.5±0.5℃下, 夏鲆61 h 40 min, 反交鲆66 h。正交及兩組回交子代在胚胎期均可正常發育。反交子代卵裂期出現異常, 僅少數胚胎可以孵化。胚胎孵化后, 在1～64日的培養過程中, 反交鲆于3～4 d內全部死亡, 回交牙鲆發育至18日齡時全部死亡。正交鲆和回交夏鲆可正常發育, 與牙鲆沒有明顯差別。

牙鲆(Paralichthys olivaceus); 夏鲆(Paralichthys dentatus); 雜交; 回交; 早期發育

雜交育種不僅可以對現有品種加入更優良的新的遺傳性狀, 也可以使兩種或兩種以上具有不同優良特性的類型結合而成更加優秀的新類型, 是魚類育種的基本手段之一[1]。雜種一代除了一些比較優良的類型可直接利用外, 還可以進行雜種與某一親本間的回交。回交是雜交育種的重要手段之一, 旨在通過雜交種與雙親之一再次雜交, 使后代加強輪回親本的某些優良性狀, 減少雜種后代的分離, 并保留非輪回親本的少數優良性狀[2]。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)與夏鲆(Paralichthys dentatus)均屬于鰈形目(Pleuronectiformes)、鰈亞目(Pleuronectoidei)、鲆科(Bothidae)、牙鲆屬(Paralichthys)。牙鲆主要分布于中國東部沿海以及朝鮮、日本、俄國遠東沿岸海區, 在中國、韓國、日本均有大規模養殖, 是優良的海水養殖種之一。夏鲆又稱夏牙鲆、大西洋牙鲆、犬齒牙鲆等, 主要分布于北美洲大西洋沿岸, 于2002年引入中國。與牙鲆相比,夏鲆耐高溫, 但越冬死亡率高, 而牙鲆渡夏困難, 能安全越冬。為培育出生長快、適溫范圍廣的養殖新品種, 本實驗室通過人工授精的方法對牙鲆和夏鲆進行雜交試驗并獲得了雜種 F1代, 利用 F1(♀)分別同牙鲆(♂)和夏鲆(♂)回交, 獲得了兩組回交子代。

目前, 國內許多學者已對牙鲆和夏鲆雜交進行了研究, 研究內容主要集中在牙鲆♀ × 夏鲆♂雜種早期發育、遺傳特征以及雜種優勢[3-7], 而對正反交及回交的胚胎發育比較以及仔稚幼魚生長比較目前尚未見報道。因此, 本研究以牙鲆和夏鲆正反交子代以及兩組回交子代為研究對象, 系統比較了正反交子代、回交子代及親本的胚胎發育時序以及仔稚幼魚的生長, 以期為鲆鰈類養殖新品種的開發提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 親魚及配子采集

牙鲆和夏鲆的雜交及回交實驗在中國科學院海洋研究所海洋生物技術工程研究發展中心進行。夏鲆親魚為2002年從美國引進的魚苗, 經過人工培育而成。牙鲆為青島本地養殖種。雌性雜交鲆來自2005年在青島連三島養殖場進行的牙鲆(♀)與夏鲆(♂)雜交實驗。共有5尾雌牙鲆, 10尾雄牙鲆, 2尾雌夏鲆,10尾雄夏鲆及2尾雌雜交鲆作為親魚用于本研究。用于繁殖的雌魚(牙鲆、正交鲆)為3齡魚, 體質量2～4 kg; 雄魚(夏鲆)為2齡魚, 體質量1～2 kg。親魚經人工誘導性成熟后采用人工擠壓腹部的方法采集精液和卵子。顯微鏡下觀察精子的運動情況, 僅運動率高于90%的精子用于實驗, 與質量好的卵子(規則圓形,顏色為半透明微黃色)通過干法授精獲得受精卵。等受精卵充分上浮后, 過濾并洗卵數次。共得到6組組合, 包括：

兩組親本組合： 牙鲆♀ × 牙鲆♂ (牙鲆)

夏鲆♀ × 夏鲆♂(夏鲆)

兩組雜交組合： 牙鲆♀ × 夏鲆♂(F1)(正交)

牙鲆♂× 夏鲆♀(反交)

兩組回交組合： 正交 F1♀ ×牙鲆♂ (回交牙鲆)

正交 F1♀ ×夏鲆♂(回交夏鲆)

1.2 受精卵培育及觀察

由于各組實驗進行的時間不同, 因此受精卵培育水溫有所差別。牙鲆、正交鲆及兩組回交鲆培育水溫為 18.0±0.5℃, 夏鲆及反交鲆培育水溫為16.5±0.5℃。鹽度 32～33, pH 7.8～8.2。每組取 500粒卵于500 mL燒杯中靜水孵化, 設3個平行樣。孵化及培養用海水預先在養殖池內進行加熱, 將燒杯懸浮于養殖池大水體中以保持孵化水溫恒定。培育期間定期取樣, 在 Nikon YS-100型顯微鏡下觀察各組合胚胎發育時序并記錄。各組剩余受精卵分別放入160 L圓柱形培養缸內進行培育, 微充氣。

1.3 正交、回交子代與牙鲆仔稚幼魚的培育及數據測量

初孵仔魚的培育水溫為 19±0.5℃, 隨仔魚發育緩慢升高至20±0.5℃, 保持此溫度進行培育。破膜仔魚開口后采用經營養強化的褶皺臂尾輪蟲(Branchionou plicatilis)、鹵蟲(Artemiaspp.)無節幼體、橈足類及其幼體和魚蝦肉糜作為仔稚幼魚的餌料系列。在仔稚幼魚培育期間(1～64日齡), 每天固定時間取樣, 每次隨機采集 10尾, 用 100 mg/L的MS-222麻醉后在解剖鏡下測定各組仔稚幼魚全長、體長、體高和肛前長等形態學特征, 用5%的福爾馬林進行固定。

1.4 統計分析

測量所得各組生長數據用 excel 2003處理,SPSS16.0軟件分析每組魚的生長情況,P＜0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 6組組合胚胎發育

正交子代及兩組回交子代的胚胎發育規律與雙親的發育規律基本一致。反交子代在分裂期出現大量畸形, 僅有少部分卵子能通過原腸期繼續發育。在孵化水溫18.0±0.5℃下, 初孵仔魚破膜用時為： 牙鲆41 h, 正交鲆47 h, 回交牙鲆42 h30 min, 回交夏鲆44 h。孵化水溫16.5±0.5℃下, 夏鲆61 h40 min, 反交鲆66 h, 具體發育時間和發育階段見表1。

2.2 正反交及回交組合與牙鲆的早期生長比較

正反交及兩組回交組合的仔魚均可孵化, 但反交鲆孵化后身體畸形, 開口前全部死亡(圖 1)。回交牙鲆從1～15日齡可正常生長, 從15日齡開始, 直至18日齡生長明顯緩慢(P＜0.05), 并最終死亡。

作者對正交鲆、回交夏鲆的仔稚幼魚生長進行測量并與牙鲆作了比較(圖2)。初孵仔魚經過64 d的生長, 正交鲆平均全長達到19.28 cm, 體長16.17 cm,體高7.62 cm, 肛前長6.54 cm; 回交夏鲆全長21.35 cm, 體長17.54 cm, 體高8.04 cm, 肛前長6.80 cm;牙鲆平均全長 21.87 cm, 體長 19.11 cm, 體高 8.97 cm, 肛前長8.38 cm。直至64日齡, 3個組合的生長情況并未見明顯差別(P＞0.05)。

表1 牙鲆與夏鲆雜交及回交胚胎發育時序的比較Tab. 1 Time-table of embryonic developments of reciprocal hybrids and backcrosses of P. olivaceus and P. dentatus

圖1 6個組合的初孵仔魚Fig. 1 Newly hatched larvae of six groups1-1. 牙鲆; 1-2. 夏鲆; 1-3. 正交鲆; 1-4. 反交鲆; 1-5.回交牙鲆;1-6. 回交夏鲆1-1. P. olivaceus; 1-2. P. dentatus; 1-3. F1; 1-4. P. dentatus(♀) ×P. olivaceus(♂); 1-5. F1(♀) × P. olivaceus(♂); 1-6. F1(♀) ×P. dentatus (♂); F1. P. olivaceus(♀) × P. dentatus(♂)

正交鲆, 回交夏鲆及牙鲆的全長與體長增幅比較平穩, 從初孵仔魚到64日齡平均日增長率分別為27.20%和23.26%。體高和肛前長的增長明顯分為3個階段, 體高的變化從初孵仔魚到22日齡為緩慢增長期,平均增長率為6.17%; 22～28日齡為快速增長期, 平均增長率為62.17%; 28～64日齡漲幅變慢, 平均增長率為7.57%。肛前長從初孵仔魚到22日齡為緩慢增長期, 平均增長率為8.67%, 22～28日齡為快速增長期, 平均增長率為 44.44%, 28～64日齡漲幅變慢, 平均增長率為3.80%。體長/體高經歷了先緩慢下降, 再快速下降, 再趨向平穩的過程。第一個拐點出現在19 d(全長/體高均值為5.6), 表明19 d之前體高比體長生長稍快, 而后體高生長迅速加快, 26 d前后是全長/體高的第二個拐點(均值 1.95), 此后全長/體高相對穩定。體長/肛前長經歷了平穩期, 快速下降以及緩慢上升3個階段。第一個拐點出現在22 d(體長/肛前長均值為2.59), 表明22 d以前體長與肛前長增長速度一致, 之后肛前長生長速度加快, 26 d前后為體長/肛前長的第二個拐點(均值1.75), 此后體長/肛前長緩慢增長, 表明26天后肛門后的軀干部生長開始加快。

圖2 牙鲆、正交鲆、回交牙鲆、回交夏鲆的早期生長Fig. 2 Early development of P. olivaceus, F1, F1(♀) × P. olivaceus(♂), F1(♀) × P. dentatus (♂)

3 討論

3.1 正反交及回交子代與親本胚胎發育比較

正反交及兩組回交的胚胎發育所經歷的發育過程與其他牙鲆屬的種基本相同, 經歷卵裂前期、卵裂期、囊胚期、原腸期、神經胚期、器官發生期和孵化出膜期 7個主要發育時期, 在發育過程中未出現明顯的特異性。

大多數魚類的胚胎發育都比較復雜, 其細胞增殖和分化同時出現, 但會以不同的速度進行[9]。在于道德[3]等的研究中提到正交鲆的的胚胎發育時間與父本牙鲆孵化時間相近, 在 15.4～16.0℃下, 雜交鲆孵化需76 h, 牙鲆為64 h, 夏鲆為77 h[11], 并非簡單介于父母本之間。該遺傳現象在弓斑東方(Fugu ocellatus)與暗紋東方(Fugu obscurus)的雜交中也有過類似報道[12]。在 18.6～21.5℃下, 雜交東方孵化需144 h50 min, 母本弓斑東方需169 h30 min,父本暗紋東方需139 h10 min。然而, 亦有大量雜交胚胎的孵化時間偏向母本, 如金魚(Carassius auratus)與大鱗副泥鰍(Paramisgurnus dabryanus)的雜交[13],狀皇姑魚(Nibea miichthtoides)與大黃魚(Pseudosciaena crocea)的雜交[14]等。

遺憾的是, 本研究中由于親魚成熟時間前后有一定差異, 完全控制在同一時間段產卵十分困難, 6組交配試驗分為兩次完成。雖然 6組組合的胚胎發育所處溫度并不完全一致, 但同在18.0±0.5℃下, 所得的回交牙鲆分別與其母本雜交鲆和父本牙鲆的胚胎發育時間相比, 孵化時間與其父本牙鲆相近。雜交魚胚胎孵化時間的這種偏父或偏母現象是受遺傳影響還是環境影響仍需進一步研究。

3.2 早期發育過程中的雜種優勢

在本研究中, 1～64日齡的正交鲆與回交夏鲆在生長速度上并未出現明顯的雜種優勢, 正交鲆工廠化養殖中所表現出的生長快的特點(未發表)在發育早期并沒有體現。在野生與馴化的虹鱒魚之間的雜交及回交研究中也報到過類似現象[8]。作者推測這可能與雜種優勢的延遲表達有關。雜種優勢源自于兩套在遺傳上有一定距離且能相容的基因組在受精時的融合, 來自父親的一套基因組被激活標志著發育過程中合子由母源性表達開始向合子表達過渡[15]。而在擬南芥(Arabidopsis spp.)[16]、玉米(Zea mays)[17]、小鼠(Mus spp.)[18]等生物中發現父本基因組存在某種程度的延遲表達現象, 使得這些雜交子代在發育早期不能表現出明顯的雜種優勢現象。因此, 正交鲆或回交夏鲆發育早期在生長上沒有明顯雜種優勢的現象有可能與父本基因組的延遲表達有關。當然, 養殖室內的培養條件也可能并非正交鲆與回交夏鲆的最適生長條件。要解釋這一問題需要對等位基因在受精后的表達進行追蹤以及對培養條件進一步優化。

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Comparison of embryonic development and growth of hybrids and backcrosses from Paralichthys olivaceus and Paralichthys dentatus

SUI Juan1, XU Shi-hong1, WANG Wen-qi2, MA Dao-yuan1, XIAO Zhi-zhong1,XIAO Yong-shuang1, LIU Qing-hua1, LI Jun1
(1. Institute of Oceanology, the Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Qingdao Agricultural University, Institute of animal science and technology, Qingdao 266109, China)

Nov., 12, 2010

Paralichthys olivaceus; Paralichthys dentatus; hybridization; backcross; early development

Reciprocal and back crosses were carried out on Paralichthys olivaceus (Po) and Paralichthys dentatus(Pd) by artificial fertilization. The embryonic and larvae development were compared among the six groups. The results showed that, at 18.0℃±0.5℃, the embryos of P. olivaceus, Po(♀) × Pd(♂), F1(♀) × Po(♂) and F1(♀) ×Pd(♂)took 41, 47, 42.5, and 44 h to hatch, respectively. At 16.5℃±0.5℃, the embryos of P. dentatus and Pd (♀) ×Po (♂)took 61 h 40 min and 66 h to hatch, respectively. For Po(♀) × Pd(♂) and two back crosses, the embryos developed normally. While most of the embryos from Pd (♀) ×Po (♂) developed with abnormal cleveage, only few embryos hatched out normally. During a 64-day cultivation of the post hatching larvae, all hybrids of Pd(♀) ×Po (♂) died at 3-4 days post hatching (dph) and F1(♀) × Po(♂) offspring died completely at 18 dph. The progenies of Po(♀) ×Pd(♂) and F1(♀) × Pd(♂) experienced normal development and growth stages as that of P. olivaceus.

S917

A

1000-3096(2012)06-0054-05

2010-11-12;

2011-01-11

現代農業產業技術體系建設專項資助項目(nycytx-50); 國家農業成果轉化資金(2009GB24910539); 中國科學院知識創新項目

(KSCX2-EW-B-3); 山東省科技發展計劃項目(2011GHy11530); 山東省中青年科學家科研獎勵基金(BS2009HZ007); 青島市基礎研究計劃項目(09-1-3 -11-jch)

隋娟(1984-), 女, 山東淄博人, 博士研究生, 主要從事海洋動物遺傳育種研究, E-mail： suijuan0313@yahoo.com.cn; 李軍, 通信作者, E-mail：junli@qdio.ac.cn; 劉清華, 通信作者, E-mail： qinghualiu@qdio.ac.cn

(本文編輯：譚雪靜)