深海熱液噴口微生物群落研究進展

魏曼曼, 陳新華, 周洪波

(1. 中南大學 資源加工與生物工程學院, 湖南 長沙 410083; 2. 國家海洋局 第三海洋研究所 海洋生物遺傳資源重點實驗室, 361005)

深海熱液噴口微生物群落研究進展

Research process of microbial community in deep-sea hydrothermal vents

魏曼曼1, 陳新華2, 周洪波1

(1. 中南大學 資源加工與生物工程學院, 湖南 長沙 410083; 2. 國家海洋局 第三海洋研究所 海洋生物遺傳資源重點實驗室, 361005)

1977年在太平洋上的加拉帕戈斯群島附近深2 500 m的深海熱液區首次發現了獨立的生命體系,它被認為是海洋生物學研究領域中最為重大的發現之一[1-2]。自此, 對深海熱液噴口生物群落的調查研究吸引了無數科學家的眼球, 成為了海洋生物學研究領域的熱點之一。30余年來, 隨著海洋生物學研究技術方法的進步, 大量的深海熱液噴口生物群落被相繼發現, 越來越多的噴口生物物種被分離鑒定出來[3-4], 從而改變了人們對深海熱液環境的認識,極大的拓展了人們的海洋生物學知識。

深海熱液噴口是一種黑暗、低氧、高壓、低營養以及富含硫化物的極端環境。這里幾乎沒有陽光,且表層海洋生物光合作用產生的有機碳只有極少量能夠到達深海, 因此形成了一類不依賴光合作用而是以微生物的化學合成為基礎的獨特生態系統[5]。通常熱液噴口規模較小, 中心溫度極高(有時會高達350℃), 外圍水體溫度較低(一般＜2℃), 溫度差異比較大, 例如在噴口周圍水溫 20℃處向外不到 1 m的距離, 水溫便可降為 2℃。因此, 獨特的生態環境使深海熱液噴口周圍的生物群落無論是在代謝上,生理上和分類上都極具多樣性[6]。其中又以微生物的種類最為豐富, 作用最為重要。另外, 急劇變化的溫度, pH及化學梯度賦予了深海熱液微生物獨特的生理生化特征, 這些獨特微生物資源的開發利用對于現有菌種資源的補充和改善具有重要意義。

1 深海熱液噴口環境

1.1 深海熱液噴口環境的形成

目前, 在太平洋, 大西洋和印度洋水深800 m到3500 m的區域中已發現了 200多處熱液噴口區[7]

(圖 1), 它們主要出現在地殼運動活躍的海洋區域[8],如大洋中脊, 弧后盆地和板內火山, 其形成是地球板塊構造的產物。大多數的海洋板塊被海洋中脊所分隔開來, 這些洋中脊可深達60 000 km。這些板塊相互分離卻又緊密相連。因此, 冰冷的海水就可沿著洋中脊系統的地殼裂縫向下滲透。在滲透過程中, 海水被逐漸加熱, 于是就產生了海水在地殼裂縫中的對流循環。在經過復雜的循環之后, 熱液流就會向上噴射, 與氧化性的低溫海水相遇。這些熱液流偏酸性,具還原性且富含重金屬(包括鐵, 錳, 鋅, 銅等)及無機分子(如H2, CH4, H2S, CO2, CO)。如果在噴射出來之前熱液流就與冷海水混合, 它們的溫度就會急劇下降(約為10～40℃)。這里就成了無脊椎動物的繁盛之所。如果噴射之前沒有與冷海水混合, 熱液流的溫度就會高達350℃甚至更高。當它們噴射而出時, 溶解于其中的礦物質元素與冷海水接觸, 就不斷有金屬硫化物沉淀形成。這些沉積物沉積在海底, 形成熱液硫化物礦床, 有時會形成高達10～15 m的海底“黑煙囪”。在海水沿著洋中脊系統的地殼裂縫循環流動的過程中, 地熱能被轉化為化學能, 儲存在還原性的無機化合物中。這些化合物是由海水與高溫的裂縫巖石反應而形成的, 通常由2000 m到3000 m水深的海底噴口(25～350℃)噴涌而出, 從而為噴口生物群落的繁殖提供了基本的物質條件。

圖1 全球主要熱液噴口區域的分布圖[7]

1.2 深海熱液噴口微生物的能量來源

在熱液噴口發現之前, 只有化能自養型的硫氧化菌是海底的已知生物, 但是如此重要的生產者在當時并不被認為對海洋生態系統有什么特別的意義[5]。熱液噴口發現不久, 硫化氫的生物氧化被推測為其能量來源[8]。隨后, 大量實驗表明, 噴口周圍化學合成活動極其頻繁, 因此, 普遍認為噴口生物生存所需的有機碳源來源于化能合成細菌。化能無機營養菌可通過噴口硫化物熱液中的H2S, S, NH4, Fe2+等還原型化學物質的氧化獲得能量, 并將 CO2合成為有機碳[9]。正是這些細菌構成了深海熱液噴口生物賴以生存的食物鏈的基礎(表1)。

表1 熱液噴口環境中潛在存在的化能無機營養菌及其電子來源[10]

2 深海熱液噴口微生物多樣性

起初, 深海熱液噴口的微生物多樣性的研究主要局限于樣品的顯微描述及有限物種的富集培養。隨著分子生物學技術的進步和系統發育方法的發展,對于深海熱液噴口微生物多樣性的認識有了大大的提高[3]。目前, 越來越多的熱液微生物被成功地培養或鑒別出來。盡管如此, 相對于熱液噴口環境中極其豐富的微生物資源來說, 這些僅占一小部分, 熱液環境中還有大量的未知微生物資源有待進一步的研究和開發利用[15]。

2.1 深海熱液噴口古菌

盡管在某些熱液硫化煙囪中古菌可能僅占總細胞的較少一部分, 但它們卻是煙囪結構某一特定部位微生物群落的主要組成成分[11-13]。例如, Takai等[14]利用熒光定量PCR和FISH技術研究發現印度洋中脊 Kairei熱液區域的硫化煙囪內部古菌比例將近達到 100%; Schrenk等[15]的研究結果表明在胡德安富卡脊, 古菌約占活性硫化煙囪外壁結構中所有微生物的 40%, 且古菌數量從煙囪的外壁向中心部位呈逐漸遞增的趨勢。其他的研究也表明古菌多樣性比預計的要高。由Takai等[11]命名為“深海熱液噴口廣古菌類群”(DHVEG)的微生物在全球深海噴口系統中估計均有分布。這一類群可再分為兩個亞類群, 即DHVE-1和DHVE-2[16]。在幾個深海熱液環境的古菌16S rRNA 克隆文庫中, DHVEG占克隆的絕大多數,其中DHVE-1高達總克隆數的93%。

表2 深海熱液噴口環境中的古菌多樣性

深海熱液環境中的古菌主要包括泉古菌, 廣古菌和初古菌門 3大類群[11-12]。表 2總結了深海熱液噴口環境中的主要古菌類群及其特征。初古菌只在環境樣品的16S rRNA文庫中檢測到, 并未見有可培養菌株的報道。事實上, 可培養菌株在深海熱液環境樣品古菌克隆文庫中的比例極小。熱球菌目(Thermococcales)是熱液噴口中最常被分離培養的超嗜熱古菌, 這些微生物被認為是海洋熱液生態系統中最主要的分解者[14-15]。它們是一類嚴格厭氧, 能夠以酵母, 蛋白胨, 淀粉等做生長底物的異養微生物,還具有還原元素硫的能力。據推測, 在深海熱液噴口,復雜的生物群落能為熱球菌的生長繁殖提供有機質,因此認為超嗜熱的熱球菌可能是熱液噴口異養活動的良好指示者[17]。甲烷八疊球菌目(Methanosarcinales)的產甲烷菌也經常能在克隆文庫中檢測到,但是這類微生物至今還無法實現分離培養[15]。

廣古菌門中, 古丸菌屬(Archaeoglobus)的兩個硫酸鹽還原菌和幾株產甲烷菌(利用 CO2和 H2產生CH4)研究較多。與古丸菌親緣關系較近的地丸菌屬(Geoglobus)可利用 Fe3+作為電子受體。甲烷球菌屬(Methanococcus)和甲烷嗜熱菌屬(Methanopyrus)是嗜熱產甲烷菌的代表菌屬[18], 具有典型的高溫生長特性(最適生長溫度98℃, 最高生長溫度110℃)。泉古菌是深海熱液噴口古菌的第二類群, 這類微生物基本都是可代謝硫和含硫化合物的超嗜熱古菌。此類群中已有幾個菌屬的代表菌株從深海熱液噴口環境中成功的分離得到, 如除硫菌屬(Desulfurococcus),葡萄熱菌屬(Staphylothermus), 熱網菌屬(Pyrodictium)和火葉菌屬(Pyrolobus), 這些分離菌株均是嚴格厭氧菌, 但卻表現為不同的代謝類型。延胡索酸火葉菌(Pyrolobus fumarii)[19]是一種能夠在最高113℃的溫度下生長的深海熱液噴口古菌(最適生長溫度106℃), 它能以硝酸鹽, 硫代硫酸鹽為底物, 可在微氧條件下生長。這是至今地球上已知的最嗜熱的微生物, 更重要的是, 它能在 120℃高壓蒸汽滅菌鍋中存活2 h。

表3 深海熱液噴口環境中細菌多樣性

由于騎行納古菌(Nanoarchaeum equitans)的發現, 提出了一個新的古菌門： 納古菌門(Nanoarchaeota)[20]。Nanoarchaeum equitans是一種與古菌Ignicoccus pacificus密切關聯的微小(400 nm)微生物。

2.2 深海熱液噴口細菌

高達 350℃的噴口熱液流的出現使微生物學家對深海熱液噴口微生物的研究主要集中在超嗜熱古菌的研究上。然而, 分子生物學技術的利用揭示了細菌群落在深海熱液噴口生境中的豐富度及重要性。表 3總結了深海熱液噴口環境中主要細菌類群及其特征。其中ε-變形菌又是細菌類群中較為豐富, 分布較為廣泛的亞門[15]。某些 ε-變形菌常與熱液噴口的腹足動物共生[21], 有些甚至是蝸牛內共生菌[22]。盡管 ε-變形菌的分布極為普遍, 但是由于其難培養性,我們對這類微生物的生理生化特征卻知之甚少。先前的研究認為 ε-變形菌主要是微氧硫氧化菌[23]。最近的研究表明 ε-變形菌具有更豐富的代謝多樣性[23]。研究表明, 深海熱液噴口ε-變形菌主要由能以硝酸鹽, 氧氣, 硫化合物為最終電子受體, 從而氧化氫氣和硫化合物的嗜中溫或嗜熱的化能無機營養菌組成[23]。一般認為, ε-變形菌不僅在深海熱液噴口的硫循環中發揮重要作用, 而且還參與熱液噴口的氫,氮, 碳循環[24]。

產水菌目(Aquificales)是深海熱液噴口化能無機營養型的另一代表類群, 它們所利用的電子受體和供體與 ε-變形菌相似[25]。如 ε-變形菌一樣, Aquificales亦普遍分布于全球的深海熱液區域[25]。由Aquificales高的生長溫度可以預測, 這類微生物只可能發現于像活性硫化煙囪或噴口熱液流等高溫環境中[16]。

深海熱液噴口中已知的非光合細菌主要包括硬壁菌門(Firmicutes), 疣微菌門(Verrucomicrobia), 棲熱菌(Thermales)和嗜胞菌-屈撓桿菌-擬桿菌(Cytophaga-Flexibacter- Bacteroides, CFB)四類。Verrucomicrobia已分別從胡德安富卡脊, 東北太平洋脊和瓜伊馬斯盆地的許多熱液位點鑒別出來[23]。這類細菌難于培養, 研究者曾在 70℃的復合有機營養富集培養基中通過不斷選擇培養獲得了一株新的Verrucomicrobia菌株, 但卻無法穩定傳代培養。

在深海熱液噴口環境樣品的克隆文庫中還鑒別出一類屬于綠彎菌門的綠色非硫細菌[21]。深海熱液噴口系統的地理化學特征為非光合作用的綠色非硫細菌提供了合適的生境, 比如在瓜伊馬斯盆地, 有機質通過熱分解轉換成了各種石油碳氫化合物, 包括不分枝烷烴, 環烷烴, 三萜, 甾烷和芳香碳氫化合物, 從而為綠色非硫細菌的生長繁殖提供底物[24]。

最近, 一些研究利用功能基因的方法大大擴展了異化性硫酸鹽還原菌(SRB)的多樣性[11]。研究者使用dsrAB基因為分子標尺, 不僅擴展了SRB的分布和多樣性, 而且表明 SRB不僅分布于熱液沉積物中還分布在活性硫化煙囪壁中。另外, dsrAB基因的系統發育調查還揭示了原先未被培養的和未被識別的潛在SRB的存在[26]。這些SRB對局部微環境的化學特征及礦化過程產生重要影響, 同時在深海熱液噴口生態系統中硫化礦的沉積和變更中發揮重要作用[27]。為了揭示硫酸鹽還原菌在深海熱液噴口發揮的潛在地理生物學作用, Hoek和Reysenbach調查了一株嗜熱的, 氫氧化硫酸鹽還原菌在硫化煙囪的陡峭地理化學梯度條件下是如何分餾硫同位素的。結果顯示,分餾的程度主要依賴于環境中氫氣的濃度。在氫氣有限的條件下,34S標記的硫化物只減少了原硫酸鹽的4‰。這個結果表明化學無機營養型的硫酸鹽還原菌在深海熱液噴口生物地球化學循環中發揮重要作用。

像鐵氧化菌一樣的金屬氧化菌是硫化物微生物風化的重要促進者, 在深海熱液噴口金屬和硫的生物地球化學循環中發揮著重要作用[28-29]。McCollum等[30]認為由每千克熱液流沉淀下來的金屬硫化物氧化產生的能量超過其中溶解化合物(H2S, CH4, Mn2+,H2)所產能量幾乎一個數量級。Edwards等[28]調查了海底環境中鐵氧化細菌在硫化礦的 Fe2+氧化過程的作用。將煙囪硫化物的拋光片放置于海底溫度約4℃的環境, 會在其上形成微生物菌落, 菌落密度與礦物基質的可溶性成正比。觀察拋光片上隨之形成的鐵氧化物發現鐵氧化物是隨著細菌的生長而形成的。Edwards等[29]利用原位培養方法分離到鐵氧化菌,進一步證實了鐵氧化菌的存在和活動與熱液噴口硫化物密切相關。分離菌株的系統發育分析表明它們是與已知鐵氧化菌關系較遠的 α或 γ變形菌。這些結果表明鐵氧化菌普遍存在并活躍于海底熱液噴口環境中。

2.3 深海熱液噴口微生物生理生化多樣性

深海熱液噴口環境陡峭的化學和物理梯度為微生物的生長提供了多種多樣的生境和能源, 從而造就了這一環境中微生物的高度多樣性。例如, 化能無機營養型微生物可以通過氧化性海水(O2, N O3-和)和還原性熱液流(H2, H2S, CH4, CO2和甲酸鹽)之間的化學梯度引起的氧化還原反應獲得能量。雖然已從深海熱液環境中成功的分離培養出來了一系列化能無機營養型微生物[5], 但這只占一小部分, 仍有大量是未培養的, 其中有些是利用稀有或罕見氧化還原力偶獲取能量生長的[31]。可見, 能利用多種電子供體和受體的微生物更適合于深海熱液噴口多變的環境和陡峭的梯度條件。這些細菌也可以在缺氧區域以 N O3-, S2O32-, Fe3+和Mn4+代替氧作為氧化劑進行生長繁殖。許多深海嗜熱菌, 包括兼性厭氧的Pyrolobus fumarii[19], 產水菌目成員[25], 除硫桿菌[32]和 ε-變形菌[24], 均表現出代謝多功能性, 以使它們在物理化學梯度多變的環境中生長良好。

深海熱液噴口環境無機碳的同化方式相當多樣,且與其物理化學條件密切相關。超嗜熱廣古菌, 如產甲烷菌和古丸菌, 通常分布在熱液環境中溫度最高的部位, 并且利用乙酰輔酶 A途徑進行 CO2的固定[33]。深海熱液噴口環境中超嗜熱泉古菌門的除硫球菌, 如火葉菌屬, 熱網菌屬, 除硫球菌屬, 燃球菌屬, 碳固定途徑仍然無法確定, 在分析了熱網菌科和除硫球菌科的酶系之后推測它們分別利用特殊的卡爾文循環和一種潛在新的碳固定途徑[34]。據證明,在混合區的較低溫度下, 海洋泉古菌 I組(MGI)是最主要的古細菌組成成分。古菌膜脂的穩定性放射性碳同位素分析表明不可培養的海洋泉古菌 I組古菌通過 3-羥基丙酸途徑固定碳酸氫鹽自養生長[35]。細菌域中, 還原性三羧酸(rTCA)循環可能是產水菌目產水菌科和Persephonella科最主要的CO2固定途徑之一。另外, 深海ε-和γ-變形菌碳固定途徑中關鍵功能基因的系統發育分析和酶的分析表明 rTCA循環可以作為深海 ε-變形菌的 CO2固定途徑, 并與 γ-變形菌的卡爾文循環一起共同促進微生物群落的初級生產[36]。

耐受陡峭變化的物理化學梯度是深海熱液噴口微生物的一個重要生理特征。溫度和靜水壓對異養超嗜熱微生物生存的影響已被廣泛研究[37]。所有的研究清楚地顯示靜水壓力升高可顯著提高耐熱性,只不過在不高于 120℃的條件下, 耐受程度均在幾分鐘到幾十分鐘之間。120℃以上熱液流中超嗜熱菌的實驗室培養與原位觀察之間的差距仍是一個謎,有待進一步研究。由于隨著熱液流與周圍海水的混合形成了潛在的有毒金屬梯度, 對金屬毒性的耐受性和敏感性也是深海熱液噴口微生物的重要生理特征。Vetriani等[38]曾假設金屬對微生物群落的毒性可能隨著重金屬濃度的降低而增加(氧化性海水稀釋比例的升高導致熱液流中重金屬濃度的降低), 這與增加的生物可利用性和溶解度相關。這個假設已被實驗證實, 實驗結果表明來自較高溫度和較強還原性生境中的嗜熱細菌和古菌對有毒金屬更敏感, 而來自較低溫度和較強還原性生境中的中溫微生物顯示出對有毒金屬的更高的耐受性[38]。顯然, 每一個物理化學參數對于單個微生物的生長和生存都有相當大的影響, 但是對于這些物理化學參數在群落水平的潛在相互作用卻不甚了解。

3 深海熱液噴口微生物群落研究方法

微生物學家在研究微生物多樣性上面臨著特殊的挑戰。宏觀生物學家可以通過形態學特征來識別新的物種, 而微生物學家則必須依靠生理特征和系統發育特征才能鑒別新的微生物物種, 更甚者對于許多微生物物種的定義還存在爭議。

3.1 傳統的培養技術

傳統微生物多樣性的研究方法依賴于微生物的實驗室培養, 它主要以細胞形態, 生長溫度, pH值,生物量, 呼吸效率, 酶活性等為依據。然而, 在實驗室重建自然環境的精確物理化學條件是很困難的,因此, 利用傳統的培養方法研究微生物多樣性通常會導致極大的偏差, 而且通過人工培養獲得的微生物只占自然環境中很小的一部分(0.001%～1.5%)。對于深海熱液噴口微生物來說, 開發合適的培養基和在實驗室重建這種極端環境更是極其困難的, 這種培養偏差就更加嚴重。但是這種傳統的實驗室培養方法對于認知深海熱液噴口微生物的生理多樣性至關重要。例如, 生長在105℃以上溫度下的古菌的鑒別擴展了生命的最高溫度極限[19]; 另外通過培養方法在深海熱液噴口區鑒別出了可利用多種電子供體和受體生長的微生物。目前, 又發展了許多改進的培養方法應用于深海熱液噴口微生物的研究, 例如,針對難培養微生物和不可培養微生物的原位培養法;BIOLOGY微量平板法。盡管如此, 僅僅通過傳統培養方法遠遠不能滿足對深海熱液噴口微生物群落及其功能的研究。然而分子生物學技術的進步, 特別是一些利用 rRNA分子及其編碼基因的技術極大的彌補了傳統方法的不足。

3.2 分子生物學方法

目前, 深海熱液噴口微生物多樣性的調查研究主要采用分子生物學和系統發育分析的方法, 避免了微生物的培養。此方法主要依賴于高度保守的rRNA分子亞單位基因和微生物代謝過程中編碼關鍵酶的功能基因。Cary等[39]綜述了這些分子系統發育方法, 并詳盡的闡述了分子生態技術應用在深海熱液噴口微生物群落研究上的新進展。如圖 2總結了微生物群落結構和功能研究的技術方法[40]。簡而言之, 首先從環境樣品中抽提基因組 DNA或 RNA,然后通過聚合酶鏈式反應(PCR)從基因組 DNA或cDNA中擴增16S rRNA。擴增產物可通過諸如克隆文庫或指紋圖譜技術(RFLP, DGGE, TGGE, SSCP)等幾種方法進行分選。由此鑒別出的獨特克隆子或單一條帶進行序列測定, 從而構建系統發育樹進行系統發育分析, 推測其分類地位, 進而揭示深海熱液環境微生物多樣性。另外, 序列信息可以用于設計特異性分子探針或引物, 通過點印記技術或原位雜交技術來鑒別樣品中的特有微生物物種; 或者通過熒光原位雜交(FISH)和實時定量 PCR技術來研究復雜環境樣品中獨特微生物類群的分布或豐度。

微生物群落功能多樣性可利用一系列不同的分子方法來研究, 并可以將其與分子系統發育多樣性進行比較。目前, 16S rRNA由于其高度保守性和特異性, 是研究微生物群落最常用的分子標尺, 然而它卻不能直接反應微生物的代謝與生理特性。一個微生物群落的潛在代謝功能可通過檢測特定代謝過程中專一的基因或 mRNA來推測。例如, 異質性硫酸鹽還原過程中的關鍵酶, 異化亞硫酸鹽還原酶,是由dsrAB基因所編碼的, 可以通過研究dsrAB基因來研究深海熱液噴口中的硫酸鹽還原菌和硫酸鹽還原活動[28]。另一個常被調查的功能基因是mcrA基因,它編碼甲烷產生過程中的關鍵酶, 甲基輔酶 M還原酶α亞基。mcrA基因已從多種不同的深海熱液噴口環境中檢測到[41]。

更詳細的微生物群落功能多樣性可以通過宏基因組方法來研究, 這一方法最終為研究不可培養的微生物多樣性和生理功能指明了方向[42]。宏基因組學是一種對直接來自于環境樣品中的微生物群體基因組進行研究的新的微生物研究領域。通過直接從環境樣品中提取全部微生物的基因組, 構建宏基因組文庫, 從而研究環境樣品所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落功能。這種方法避開了環境微生物分離培養的難題, 在挖掘和利用未培養微生物資源, 篩選新穎生物活性物質方面具有極大的潛力。目前, 宏基因組研究已滲透到生物學的各個研究領域,在海洋極端環境微生物研究、深海微生物多樣性探索中具有十分重要的應用前景。

圖2 微生物群落結構研究的技術方法[40]

4 展望

深海熱液噴口微生物群落是深海生物圈的一個重要組成部分, 極端的生存環境使得這些生物具有十分獨特的生理生化特征和能量代謝途徑, 對這些獨特微生物資源開發利用的前景非常廣闊。然而由于其特殊的生存環境, 深海熱液噴口微生物的實驗室分離培養較為困難, 因此改進對熱液微生物的篩選、分離和培養技術, 提出新思路, 設計新的分離程序, 盡可能多地分離未知微生物, 了解它們在海洋生態環境中的作用, 是深海熱液噴口微生物資源開發利用的重要前提和關鍵之一。

另外, 深海底生物處于獨特的物理、化學和生態環境中, 尤其熱液噴口區的生物在高壓、劇變的溫度梯度和高濃度的有毒物質包圍下, 形成了極為獨特的生物結構、代謝機制, 體內產生了特殊的生物活性物質, 例如嗜堿、耐壓、嗜熱、嗜冷、抗毒的各種極端酶。這些特殊的生物活性物質功能各異, 是深海底生物資源中最具應用價值的部分。可以預料, 深海熱液生物資源在工業、醫藥、環保等領域將發揮重大的經濟價值。

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Q938.8

A

1000-3096(2012)06-0113-09

2011-12-05;

2012-02-23

國家自然科學基金項目(40646029); 教育部新世紀優秀人才支持計劃(NECT-06-0691); 國際海底區域研究開發“十一五”項目(DYXM-115-02-2-07); 海洋公益性行業科研專項經費資助項目(200805032)

魏曼曼(1982-), 女, 碩士研究生, 研究方向： 微生物生態學,電話： 13764230368, E-mail： wwyymm_6@163.com

(本文編輯：梁德海)