麝香草酚抑菌活性及其影響因素研究

王 娣，謝海偉，曹珂珂，柯春林，錢時(shí)權(quán)，石亞中，任茂生

（蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽蚌埠 233030）

麝香草酚抑菌活性及其影響因素研究

王 娣，謝海偉，曹珂珂，柯春林，錢時(shí)權(quán)，石亞中，任茂生

（蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽蚌埠 233030）

采用濾紙片法和擴(kuò)散法，研究不同濃度的麝香草酚對食品中常見10種污染菌的體外抑菌作用，并對其抑菌影響因素進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，麝香草酚對細(xì)菌、酵母和霉菌均有一定抑制作用。經(jīng)測定，麝香草酚對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、變形桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱乳酸鏈球菌、異常漢遜氏酵母、釀酒酵母、黑曲霉、黃曲霉的最低抑菌濃度分別為10、20、20、40、40、40、80、40、80、160μg/mL。抑菌影響因素研究表明，吐溫-80和有機(jī)氮（BSA）能明顯消弱麝香草酚的抑菌能力；低pH則會明顯增強(qiáng)麝香草酚的抑菌作用。

麝香草酚，抑菌活性，最低抑菌濃度，影響因素

麝香草酚（Thymol），別名百里酚、5-甲基-2-異丙基酚，是一種單萜酚，主要存在于唇形科百里香屬植物中，是百里香屬植物揮發(fā)油的主要成分[1-2]。百里香屬植物是一種多用途植物，在我國主要分布于甘肅、內(nèi)蒙古、陜西、山西等地區(qū)[3]，可作為天然調(diào)味品、藥用植物、蜜源植物等開發(fā)利用。目前使用的麝香草酚多從百里香屬植物揮發(fā)油中提取[4-6]，具有宜人香氣。鐘少樞等[7]采用麝香草酚等七種單離食用香料對食品腐敗菌的抑菌活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明麝香草酚對細(xì)菌、霉菌和酵母均具有一定的抑制能力。閉興明等人[8]測定了麝香草酚對臨床分離紅色毛癬BMU01672株、釀酒酵母標(biāo)準(zhǔn)株和24株臨床分離耐氟康唑（FLC）白色念珠菌的最小抑菌濃度，發(fā)現(xiàn)麝香草酚有較好的抗真菌活性。麝香草酚具有抑菌作用機(jī)理可能是[9]：與細(xì)胞膜蛋白質(zhì)相互作用，引起跨膜質(zhì)子的倒流，影響了由質(zhì)子驅(qū)動供能的細(xì)胞活性；或者與微生物生長所必需物質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致微生物死亡等。本文嘗試采用濾紙片法及擴(kuò)散法研究麝香草酚對食品中10種常見污染菌的抑制活性，并對其影響因素進(jìn)行初探，為其作為天然食物防腐劑的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與設(shè)備

麝香草酚 無色片狀結(jié)晶，有特殊香味，分子式C10H14O，麝香草酚＞98%，分析純，天津博迪化工股份有限公司；金黃色葡萄球菌（StapHylococcus aureus）GIM 1.55、枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis）GIM 1.131、大腸桿菌（Escherichia coli）GIM 1.154、變形桿菌（Proteus vulgaris）GIM 1.192、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）GIM 1.189、嗜熱乳酸鏈球菌（Streptococus thermopHilus）GIM 1.83、酵母異常漢遜氏酵母（Hansenula anomala）GIM 2.18、釀酒酵母（Saccharmuces cerevisiae）GIM 2.34、霉菌黑曲霉（Aspergillusniger）GIM 3.24、黃曲霉（Aspergillus flavus）GIM 3.18 廣州微生物研究所；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（BPA） 培養(yǎng)金黃色葡萄球菌（StapHylococcusaureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、變形桿菌（Proteus vulgaris），用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，每100m L中加入95%的酒精5m L（BPAE）；乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（MRS瓊脂培養(yǎng)基） 培養(yǎng)保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜熱乳酸鏈球菌（Streptococus thermopHilus）；馬鈴薯汁葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA） 培養(yǎng)異常漢遜氏酵母（Hansenula anomala）、釀酒酵母（Sacchromuces cerevislac）、黑曲霉（Aspergillus niger）、黃曲霉（Aspergillus flavus）。

LRH-150-II智能生化培養(yǎng)箱、SW-CJ-2F超凈工作臺 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LDZX-40BI高壓滅菌鍋 北京京儀東方科技有限公司；LX41多功能顯微鏡 上海富眾生物科學(xué)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸浮液的制備 將供試菌種劃線接入試管斜面培養(yǎng)基上，細(xì)菌于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，酵母于28℃培養(yǎng)48h，霉菌于28℃培養(yǎng)5d，4℃冰箱中冷藏備用。用接種環(huán)分別挑取少許培養(yǎng)成熟的細(xì)菌、酵母菌和霉菌孢子于裝有玻璃珠和10m L無菌生理鹽水的三角瓶中，振蕩，采用活菌計(jì)數(shù)法測定菌數(shù)[10]，制成菌體或孢子濃度為106~107CFU/m L均勻的菌懸浮液或孢子懸液。

1.2.2 不同濃度麝香草酚的制備 由于麝香草酚不溶于水，可加入少許吐溫-80增溶[11]，再加適量無菌水超聲乳化、定容，配制成500、800、1000μg/m L系列濃度的麝香草酚（吐溫-80含量不超過0.5%）。以0.5%的吐溫-80作為對照。

1.2.3 濾紙片法[12]取滅菌后的濾紙圓片（d=6mm）于麝香草酚中浸泡10min，瀝去多余液體，置于已用0.1m L菌懸液涂布均勻的培養(yǎng)皿中，每個菌種做3次平行。細(xì)菌恒溫培養(yǎng)24h，酵母培養(yǎng)48h，霉菌培養(yǎng)5d，測量抑菌圈直徑。

1.2.4 擴(kuò)散法（打孔法）[13]用無菌打孔器（孔徑6mm）在用0.1m L菌懸液涂布均勻的培養(yǎng)皿中十字對稱打4個孔，用無菌微量移液器分別加入100μL不同濃度的麝香草酚，每種菌做3個平行，測量抑菌圈直徑。

1.2.5 最低抑菌濃度（MIC）的測定[13]用無菌打孔器（孔徑6mm）在用0.1m L菌懸液涂布均勻的培養(yǎng)皿中打4個孔，其中一個加0.5%的吐溫-80作為對照，其它分別加入2.5～320μg/m L系列濃度的麝香草酚100μL，每種菌做3個平行，得到最低抑菌濃度（M IC）。

1.2.6 麝香草酚抑菌作用的影響因素研究

1.2.6.1 乳化劑（吐溫-80）對麝香草酚抑菌作用的影響 麝香草酚加吐溫-80增溶，稀釋，使制備的培養(yǎng)基中麝香草酚含量達(dá)到200μg/m L，吐溫-80（含量為0.25～8μL/m L）系列濃度。選取對麝香草酚敏感的3種供試菌：StapHylococcus aureus、Bacillus subtilis、Escherichia coli，制備菌懸浮液，取0.1m L菌懸液在上述培養(yǎng)基中涂布均勻，培養(yǎng)成熟，計(jì)算各皿菌落數(shù)，計(jì)算lgCFU/m L。

1.2.6.2 有機(jī)氮（BSA）對麝香草酚抑菌作用的影響麝香草酚加吐溫-80增溶，稀釋，使制備的化學(xué)合成培養(yǎng)基中麝香草酚含量為200μg/m L。將8mg/m L牛血清白蛋白（BSA）添加到化學(xué)合成培養(yǎng)基中，取0.1m L菌懸液在上述培養(yǎng)基中涂布均勻，培養(yǎng)成熟，計(jì)算lgCFU/m L。

1.2.6.3 pH對麝香草酚抑菌作用的影響 麝香草酚加吐溫-80增溶，稀釋，使制備的培養(yǎng)基中麝香草酚含量為200μg/m L，吐溫-80含量為4μL/m L，將培養(yǎng)基的pH分別調(diào)至5.0、5.5、6.0、6.5。取0.1m L菌懸液在上述培養(yǎng)基中涂布均勻，培養(yǎng)成熟，計(jì)算lgCFU/m L。

2 結(jié)果與分析

2.1 濾紙片法及擴(kuò)散法抑菌測試結(jié)果

表1 濾紙片法測得不同濃度麝香草酚的抑菌直徑（mm）Table 1 The antimicrobial diameter of different concentration thymol by filter paper disks tests（mm）

表2 擴(kuò)散法測得不同濃度麝香草酚的抑菌直徑（mm）Table 2 The antimicrobial diameter of different concentration thymol by diffused tests（mm）

抑菌活性研究表明見表1、表2，麝香草酚對細(xì)菌、酵母和霉菌均有較強(qiáng)的抑制作用，是一種廣譜性抑菌劑。當(dāng)麝香草酚含量為1000μg/m L時(shí)，濾紙片法測定的抑菌直徑大小次序?yàn)椋篍scherichia coli＞StapHylococcus aureus＞Bacillus subtilis＞Saccharmuces cerevisiae＞Proteus vulgaris＞Lactobacillus bulgaricus＞Streptococus thermopHilus＞Hansenula anomala＞Aspergillus niger＞Aspergillus flavus。擴(kuò)散法測定的抑菌直徑大小次序?yàn)椋篠tapHylococcus aureus＞Escherichia coli＞Bacillus subtilis＞Lactobacillus bulgaricus＞Proteus vulgaris＞Saccharmucescerevisiae＞Hansenulaanomala＞StreptococusthermopHilus＞Aspergillusniger＞Aspergillus flavus。抑菌結(jié)果之所以有差別，可能是每次加入的菌懸液濃度有誤差，或者實(shí)驗(yàn)操作有誤差所致。

2.2 最低抑菌濃度（MIC）的測定

麝香草酚對10種供試菌的最低抑菌濃度：StapHylococcus aureus10μg/m L；Bacillus subtilis“－”表示抑菌實(shí)驗(yàn)陰性。

20μg/m L；Escherichia coli20μg/m L；Proteus vulgaris40μg/m L；Lactobacillusbulgaricus40μg/m L；Streptococus thermopHilus40μg/m L；Hansenula anomala80μg/m L；Saccharmuces cerevisiae40μg/m L；Aspergillus niger80μg/m L；Aspergillus flavus160μg/m L。細(xì)菌的最低抑菌濃度為10～40μg/m L，酵母的最低抑菌濃度為40～80μg/m L，霉菌的最低抑菌濃度為80～160μg/m L。由表3可以看出，麝香草酚對細(xì)菌抑制作用＞酵母菌＞霉菌。對霉菌抑制作用相對較弱可能是由于霉菌大多是通過孢子繁殖，而麝香草酚是通過培養(yǎng)基擴(kuò)散與細(xì)胞接觸，因而對孢子抑制作用稍差。

表3 麝香草酚對供試菌的最低抑菌濃度Table 3 MIC of thymol to differentbacteria

2.3 影響麝香草酚抑菌作用因素研究

2.3.1 乳化劑（吐溫-80）對麝香草酚抑菌作用的影響 由表4可知，乳化劑吐溫-80對麝香草酚的抑菌作用會產(chǎn)生一定影響。培養(yǎng)基中麝香草酚的濃度為200μg/m L，完全可以抑制供試菌的生長。培養(yǎng)基中吐溫-80濃度較低時(shí)（＜1.0μL/m L），檢測不到細(xì)菌菌落。當(dāng)吐溫濃度由1.0μL/m L增加到8.0μL/m L時(shí)，StapHylococcus aureus菌數(shù)則由8.3（lgCFU/m L）增加到11.3（lgCFU/m L），這說明隨著吐溫-80濃度的增加，麝香草酚的抑菌作用在消弱，細(xì)菌的菌落數(shù)不斷上升。分析原因可能是麝香草酚與供試菌的細(xì)胞膜蛋白質(zhì)通過氫鍵或疏水作用相結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性或失活，造成細(xì)菌細(xì)胞生理功能紊亂死亡，這種現(xiàn)象會被吐溫-80乳化劑消弱，因?yàn)槿榛瘎┮材芘c酚類物質(zhì)結(jié)合，所以降低了和供試菌蛋白質(zhì)結(jié)合的麝香草酚相對濃度。此外，吐溫-80還有增溶作用，會增加麝香草酚在水中的溶解度，減少其在細(xì)胞膜上的濃度，使麝香草酚和供試菌蛋白質(zhì)結(jié)合的數(shù)量和程度大為下降，降低了麝香草酚的抑菌能力。

表4 吐溫-80濃度對麝香草酚抑菌作用的影響Table 4 Effectof Tween 80 concentration on antimicrobial activity of thymol

表5 BSA對麝香草酚抑菌作用的影響Table 5 Effect of BSA on antimicrobial activity of thymol

2.3.2 有機(jī)氮（BSA）對麝香草酚抑菌作用的影響 由表5可知，有機(jī)氮（BSA）對麝香草酚的抑菌能力有明顯的減弱作用。在不加牛血清白蛋白（BSA）只加麝香草酚的化學(xué)合成培養(yǎng)基上，麝香草酚表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌作用，細(xì)菌基本上不能生長。同時(shí)添加了麝香草酚和牛血清白蛋白（BSA）的培養(yǎng)基上，BSA可基本抵消麝香草酚的抑菌作用。可能是BSA與麝香草酚結(jié)合，使麝香草酚和細(xì)胞膜蛋白質(zhì)結(jié)合的機(jī)會和能力大大下降，降低了麝香草酚的抑菌作用。

2.3.3 pH對麝香草酚抑菌作用的影響 由表6可知，隨著pH的降低，麝香草酚的抑菌能力逐漸增強(qiáng)。pH為6.5時(shí)，有大量細(xì)菌生長；pH降低為5時(shí)，細(xì)菌基本上不能生長。可能是低pH降低了細(xì)菌活性，改變了細(xì)菌生長的外環(huán)境，使細(xì)菌不易生存，或者使麝香草酚的疏水性增加，使其更利于和細(xì)菌細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性或活性降低，造成細(xì)胞死亡。

表6 pH對麝香草酚抑菌作用的影響Table 6 Effectof pH on antimicrobial activity of thymol

3 結(jié)論

麝香草酚對食品中常見的細(xì)菌、酵母菌和霉菌有一定抑菌作用。抑菌影響因素研究表明，隨著吐溫-80濃度的增加，麝香草酚的抑菌能力會明顯消弱；培養(yǎng)基中添加有機(jī)氮（BSA）會明顯消弱麝香草酚的抑菌能力；低pH則會明顯增強(qiáng)麝香草酚的抑菌能力。從植物中尋找毒副作用小、安全性高的天然植物防腐劑，一直是科學(xué)工作者研究的熱點(diǎn)[14]。麝香草酚是從可食用植物中提取出來的，安全性高，資源豐富，希望作為一種良好的天然食品防腐劑開發(fā)使用。

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Study on antim icrobialactivity of thymoland its influencing factors

WANG Di，XIE Hai-wei，CAO Ke-ke，KE Chun-lin，QIAN Shi-quan，SHIYa-zhong，REN Mao-sheng
（Departmentof Biology and Food-Engineering，Bengbu College，Bengbu 233030，China）

The antim icrobial activity of thymol to 10 im portant foodborne pathogens bacteria and influencing factors were studied by means of filter paper disks and d iffused tests.The results showed that foodborne pathogens bacteria were obviously inhibited.The test ob tained the m inimum inhibition concentrations of thymol to foodborne pathogens bac teria，inc lud ing StapHylococcus aureus，Bacillus sub tilis，Escherichia coli，Proteus vulgaris，Lactobacillus bulgaricus，Strep tococus thermopHilus，Hansenula anomala，Saccharmuces cerevisiae，Aspergillus niger，Aspergillus flavus，were as follows：10，20，20，40，40，40，80，40，80 and 160μg/m L.The factors affecting antibac terial action experiment results showed that Tween-80 and BSA remarkab ly decreased the antibac terialaction and low pH condition strong ly increased antibacterialaction.

thymol；antim icrobialactivity；m inimum inhibition concentrations（MIC）；influencing factor

TS201.2

A

1002-0306（2012）14-0096-04

2011－12－05

王娣（1976-），女，碩士，副教授，主要從事食品生物技術(shù)的教學(xué)和研究工作。

安徽省高校優(yōu)秀青年人才基金項(xiàng)目（2010SQRL116）。