不同直投式發酵劑中嗜熱鏈球菌的全細胞蛋白電泳分析

徐愛才，馬成杰，杜昭平，華寶珍

（乳業生物技術國家重點實驗室，光明乳業股份有限公司技術中心，上海 200436）

不同直投式發酵劑中嗜熱鏈球菌的全細胞蛋白電泳分析

徐愛才，馬成杰，杜昭平，華寶珍

（乳業生物技術國家重點實驗室，光明乳業股份有限公司技術中心，上海 200436）

利用M17選擇性培養基對不同直投式發酵劑中的嗜熱鏈球菌進行分離；對嗜熱鏈球菌的全細胞蛋白提取的方法進行了摸索，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳對不同來源的嗜熱鏈球菌進行了全細胞蛋白電泳分析。利用軟件Gel Compar 4.0對蛋白圖譜進行分析，得出了7個菌株之間的遺傳相似系數矩陣，結果表明，不同來源的嗜熱鏈球菌蛋白表達圖譜有一定差異，全細胞蛋白電泳分析能較清晰的分辨至同種之間不同菌株水平。

乳酸菌，全細胞蛋白電泳，聚類分析

發酵劑是酸乳生產的關鍵點，其一般由嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌組成。嗜熱鏈球菌在酸乳發酵過程中產酸、胞外多糖、雙乙酰、甲醛等風味物質，其在酸乳的風味方面起著重要作用。不同的嗜熱鏈球菌菌株有著不同的酸化速度、產粘能力、抗噬菌體等特性[1-2]。目前，我國酸奶生產所使用的發酵劑多為從丹麥漢森、丹尼斯克等公司引進的直投式發酵劑（Direct Vat Set，DVS），由于優良菌株的選育、分析、組合等核心技術的缺乏，我國尚未能大規模生產和國外相同性能的DVS。前期研究工作中，劉鑫等[3]利用隨機擴增多態性DNA（random amplification of polymorphic DNA，RAPD）技術研究表明，不同來源酸乳中的嗜熱鏈球菌菌株在分子水平存在遺傳異質性，RAPD、RFLP、AFLP、DGGE、rep-PCR等分子生物學技術相繼應用于乳酸菌同種不同菌株間的鑒定與差異分析[4-6]。蛋白質是基因表達的產物，不同種或同種不同菌株間由于基因的差異亦能反映到所表達的蛋白質中[7-8]，因此，可以利用蛋白電泳技術建立一種直接、快速、有效的乳酸菌分析方法。嗜熱鏈球菌為革蘭氏陽性細菌，其細胞壁較厚而難以獲得全細胞蛋白，國內外少有對嗜熱鏈球菌全細胞蛋白提取方法的系統的研究報道。本文對嗜熱鏈球菌細胞破壁方法進行了研究，并在此基礎上利用SDS-PAGE對全細胞蛋白裂解液進行了分析，以期建立嗜熱鏈球菌同種不同菌株的分析方法，為優良菌株的分析鑒定、我國DVS的研究與開發提供技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

822型發酵劑、YF4型發酵劑 丹麥H公司；YT型發酵劑 美國C公司；30型發酵劑、95型發酵劑 丹麥D公司；CY型發酵劑 意大利L公司；MYE型發酵劑 法國R公司，以上均在光明乳業股份有限公司技術中心保存；溶菌酶 Sigma公司；低分子量蛋白MARKER Generay公司；小牛血清白蛋白（BSA）北京普博欣生物科技有限責任公司；聚丙烯酰胺、考馬斯亮藍R-250、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、甘氨酸、溴酚藍 Am resco公司；M 17培養基（蛋白胨5.0g，聚蛋白胨5.0g，牛肉浸膏2.5g，甘油磷酸二鈉1 9g，酵母提取物5.0g，抗壞血酸0.5g，硫酸鎂0.15g，定容至1L，M 17固體培養基添加1.5%瓊脂） 其他成分與M 17液體培養基相同，Merck公司。

M IR-253生化培養箱 日本SANYO公司；SA-300VF滅菌鍋 德國Sturdy Industrial公司；TDL-40B離心機 上海安亭公司；CA-1480-3超凈工作臺 上海凈化設備公司；UV2l00紫外分光光度計 尤尼柯儀器有限公司；GEL LOGICAL 200凝膠成像系統Kodak公司；Sonics超聲破膜裝置 美國Branson公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 嗜熱鏈球菌的分離與純化 各種發酵劑經適當梯度稀釋后涂布于M 17平板上，37℃培養24h后挑取單菌落至M 17液體培養基中，37℃培養過夜，次日取適量菌液梯度稀釋涂布于M 17培養基平板上，重復純化幾次后用12種不同糖進行糖發酵實驗。4℃保存。

1.2.2 菌體處理 從保存的平板上挑取單菌落至含M 17液體培養基的試管中，37℃培養過夜，次日按2%接種量接入100m L M 17液體培養基中，37℃培養至穩定期。將所得培養液8000r/m in離心5m in，菌體用0.05mol/L的Tris-HCl（pH 6.8）重懸洗滌兩次，離心棄上清后用0.05mol/L的Tris-HCl稀釋至同一OD值備用。

1.2.3 蛋白濃度的測定 以小牛血清蛋白為標準蛋白制作標準曲線，按照Bradford方法測定蛋白濃度[9]。

1.2.4 超聲波破碎對嗜熱鏈球菌破壁的影響 取一定濃度的菌懸液，在冰浴條件下利用超聲破細胞壁，參數設置：500W，工作5s，間歇5s，全程時間分別為5、15、30、45、60m in，結束后8000r/m in離心5m in，取上清測定不同超聲破壁時間處理后上清液中的蛋白濃度。

1.2.5 不同溶菌酶濃度對嗜熱鏈球菌破壁的影響取一定濃度的菌懸液，加入溶菌酶至終濃度分別為0.2、0.5、1.0、2.0、4.0mg/m L，旋渦振蕩器混勻，37℃酶解3h后，8000r/min離心5min，取上清測定不同溶菌酶濃度處理后上清液中的蛋白濃度，并以相同濃度的溶菌酶溶液做對照。

1.2.6 液氮研磨及液氮凍融研磨復合處理對嗜熱鏈球菌破壁的影響 取一定濃度的菌懸液，離心，上清轉移至滅菌試管中，將所得菌體轉移至經滅菌處理的陶瓷研缽中，小心倒入液氮，反復研磨菌體3次，結束后利用上清對研缽進行沖洗，洗滌液8000r/m in離心5min，取上清測定液氮研磨后上清液中的蛋白濃度；同時取等量菌懸液經液氮反復凍融三次后采取同上處理，對比兩種處理后上清液中的蛋白濃度。

1.2.7 全細胞蛋白電泳[10]SDS-PAGE凝膠的制備：采用12%的分離膠（pH 8.8）和5%的濃縮膠（pH 6.8）。

點樣：將菌體裂解液8000r/m in離心5m in，取上清測定蛋白濃度，經適當稀釋后與5倍上樣緩沖液混勻煮沸5min，點樣。

電泳：濃縮膠采用80V，分離膠采用120V，直至溴酚藍遷移至離凝膠下端1cm時停止電泳。電泳結束后經染色、固定、脫色后，照相觀察。

1.2.8 數據處理及聚類分析 對SDS-PAGE電泳圖譜的蛋白條帶進行統計，將特定位置上有蛋白條帶的記為1，無條帶的記為0，利用Gel Compar 4.0 software package，以UPGMA（method of unweighted pair group with mathematic averages）法生成遺傳相似系數[11]。

2 結果與分析

2.1 嗜熱鏈球菌菌株的分離純化與鑒定

來源于不同發酵劑的菌株經過分離、純化、鏡檢觀察菌體形態一致后，利用溴甲酚紫做指示劑進行糖發酵實驗，糖發酵實驗雖然工作量大，但仍然是鑒定乳酸菌最基本最可靠的方法之一。糖發酵結果見表1，從表1可以看出，蔗糖、果糖、乳糖、葡萄糖發酵結果相同，菌株均為陽性，而其他糖的發酵結果都為陰性，根據《伯杰細菌鑒定手冊》鑒定結果為嗜熱鏈球菌。將從不同發酵劑中分離得到的嗜熱鏈球菌菌株分別記為1、2、3、4、5、6、7。

表1 菌株的糖發酵實驗結果Table 1 Results of differentbiochemistry testof S.thermophilus

2.2 超聲破碎對嗜熱鏈球菌破壁的影響

菌懸液經超聲波破碎后離心，上清液中的可溶性蛋白濃度隨超聲時間變化見圖1，從圖1可知，超聲時間在5~30m in范圍內，上清液中的可溶性蛋白濃度隨著超聲時間的延長逐漸增大，在超聲30m in時達到1.6mg/m L，但超過30min后有一定的下降趨勢，可能與超聲處理過程中所產生的高溫對蛋白的降解或變性沉淀有關[12]。

圖1 不同超聲時間處理嗜熱鏈球菌上清液中的蛋白濃度Fig.1 Effectof differentultrasonic time of protein concentration in the supernatantof S.thermophilus

2.3 不同溶菌酶濃度對嗜熱鏈球菌破壁的影響

菌懸液經溶菌酶酶解后離心，上清液中的可溶性蛋白濃度隨溶菌酶工作濃度變化見圖2。從圖2可知，溶菌酶濃度在0.2~1.0mg/m L范圍內，隨著溶菌酶工作濃度的提高，上清液中的可溶性蛋白濃度逐漸升高，由1.2mg/m L升至2.2mg/m L，酶濃度由1mg/m L升至4mg/m L時，上清液中的可溶性蛋白濃度幾乎不再增加，僅從2.2mg/m L增加至2.4mg/m L，這可能與酶促反應底物飽和有關[13]。

圖2 不同溶菌酶濃度處理嗜熱鏈球菌上清液中的蛋白濃度Fig.2 Effect of different lysozyme concentration treatmentof protein concentration in the supernatantof S.thermophilus

2.4 液氮研磨及液氮凍融研磨復合處理對嗜熱鏈球菌破壁的影響

菌體經液氮研磨后，洗滌液離心，上清液中的蛋白濃度為1.2mg/m L，而采用液氮反復凍融和液氮研磨復合處理的上清液中的蛋白濃度達到3.8mg/m L，上清液中的蛋白濃度提高2倍以上，這可能與細胞壁在反復凍融過程中由于冰晶體的不斷作用，內部的化學鍵遭到破壞，從而再經液氮研磨時細胞壁更易破碎有關。同時，該方法與超聲波破壁法和溶菌酶酶解破壁法相比，不僅上清液中的蛋白濃度有所提高，而且克服了超聲波破碎過程中高溫對蛋白的降解及溶菌酶酶解后溶菌酶自身對蛋白的影響，為獲得嗜熱鏈球菌全細胞蛋白的最佳方法。

圖3 液氮研磨和液氮凍融研磨后上清液中的蛋白濃度Fig.3 Effectof liquid-nitrogen grinding and liquid-nitrogen grinding after frozen and thawed of protein concentration in the supernatantof S.thermophilus

2.5 蛋白圖譜分析

采用SDS-PAGE方法對不同來源的嗜熱鏈球菌全細胞蛋白進行分析，結果見圖4。從圖4可以看出，不同來源的嗜熱鏈球菌蛋白圖譜有一定的相似性，但不同菌株之間仍有一定的差異。利用Gel Compar 4.0 software package對蛋白圖譜進行光密度分析。分析結果見表2，從表2可知，不同菌株之間的蛋白圖譜相似系數都在80%以上，這說明菌株都為同一種[14-16]，這與生理生化特征鑒定結果一致。來自同一品牌的不同型號的菌株之間的蛋白圖譜相似性達到90%以上，如1和4來自丹麥H公司，相似系數為91.6%，但在42.7~66.2ku處有一明顯差異，3和5來自丹麥D公司，相似系數為90.9%，但在20.1~31.0ku處也有明顯差異。分析結果表明全細胞蛋白電泳技術不僅能分辨出不同品牌發酵劑中同種菌株之間的差異性，而且對同一品牌中不同型號的發酵劑中同種菌株仍能進行鑒定，能夠達到分辨菌株的水平。

圖4 嗜熱鏈球菌全細胞蛋白電泳圖Fig.4 Whole cell protein profiles of S.thermophilus by using SDS-PAGE

表2 嗜熱鏈球菌菌株之間的相似系數Table 2 Coefficients of similarity between each two strains of S.thermophilus

3 結論與討論

乳酸菌以其獨特的生物學性能廣泛應用于乳品、醫藥、飼料等行業中，并呈現出前所未有的商業價值。同種、不同種菌株有著很大的生產性能差異，對于工業生產而言，優良菌株的篩選、鑒定是一項十分重要的工作。因此，一種穩定、快速的鑒定方法對優良菌種的篩選和鑒定顯得尤為重要。傳統的乳酸菌鑒定方法利用形態學和生理學特征的差異等進行鑒定，可以在一定程度上反映菌株的代謝能力，但是該方法不僅耗時耗力且存在著重復性差和分辨力低等缺點[17]；現代DNA分子標記技術則因不同的分析方法可能結果不完全一致而呈現一定的缺陷性[18]；而全細胞蛋白電泳技術雖能分辨至菌株水平，但還是不能單獨勝任菌種的鑒定[14]。以上說明各種鑒定方法都有一定的局限性，單一的一種技術很難對乳酸菌進行準確的鑒定，只有把各種方法結合起來進行比較研究，優勢互補，才會使乳酸菌的分類鑒定更為準確。

本研究利用SDS-PAGE對不同品牌發酵劑中的嗜熱鏈球菌的全細胞蛋白的多樣性進行了分析，結果表明，不同品牌發酵劑中的嗜熱鏈球菌的蛋白圖譜相似系數達到80%以上，但不同品牌發酵劑中的嗜熱鏈球菌菌株之間存在一定的差異；而同一品牌不同型號發酵劑中的嗜熱鏈球菌的蛋白圖譜之間相似系數達到90%以上，但亦有一定的差異。不同菌株蛋白表達的差異可能與菌株的生化性能及風味存在一定的關系，后續將進一步對菌株的蛋白差異性進行分析，以期利用基因敲除技術、蛋白組學等技術，研究基因、蛋白、風味之間的關系，為優良菌株的分析鑒定以及我國DVS的研究與開發提供技術基礎。

[1]Purwandari U， Shah N P， Vasiljevic T.Effects of exopolysaccharide-producing strains ofStreptococcus thermophiluson technological and rheological properties of settype yoghurt[J].InternationalDairy Journal，2007（17）：1344-1352.

[2]CERNING J.Exocellular polysaccharides produced by lactic acid bacteria[J].FEMSMicrobiol Lett，1990，87：113-130.

[3]劉鑫，馬成杰，楊雙熙，等.市售酸乳中嗜熱鏈球菌的分離及RAPD分析[J].食品科學，2009，30（11）：185-188.

[4]Isable L，Carmen T，Fernanda R L.Genetic typification by pulsed-field gel electrophoresis（PFGE）and random ly amplified polymorphic DNA（RAPD）of wildLactobacillus plantarumandOenococcus oeniwine strains[J].European Food Research and Technology，2008，227：547-555.

[5]Milica N，Amarela T V，Branko J，et al.Characterization of lactic acid bacteria isolated from Bukuljac，a homemade goat’s milk cheese[J].International Journal of Food Microbiology，2008，122：162-170.

[6]Belaj A，Satovic G，Cipriani L，et al.Comparative study of discriminating capacity of RAPD，AFLP and SSRmarkers and of their effectiveness in establishing genetic relationships in olive [J].Theor Appl Genet，2003，107：736-744.

[7]Leisner JJ，VancanneytM，Rusul G，et a1.Identification oflactic acid bacteriaconstituting the predominating microflora in an acid-fermented condiment（tempoyak）popular in Malaysia[J]. International Journal of Food Microbiology，2001，63：149-157.

[8]Swircicka I.Protein profile and biochemical properties ofBacillus circulansisolated from intestines of small free-living animals in Poland[J].Folia Microbiol，2001，46（2）：165-171.

[9]Bradford MM.A rapid and sensitivemethod for thequantitation ofmicrogram quantitiesofprotein utilizing theprincipleofproteindye binding[J].Analytical Biochemistry，1976，72：248-254.

[10]厲萬龍.生物化學與分子生物學實驗技術[M].杭州：浙江大學出版社，2000.

[11]Vandamme P，Torck U，Falsen E，et al.Whole-cell protein electrophoretic analysis ofviridans streptococci：evidence for heterogeneity among streptococcusmitis biovars[J].International Journal of Systematic Bacteriology，1998，48：117-125.

[12]黃國平，溫其標，楊曉泉，等.超聲波法提取玉米醇溶蛋白的研究[J].糧食加工，2002，28（10）：1-4.

[13]闞建全.食品化學[M].北京：中國科學技術出版社，2002：111-115.

[14]Apichart N，Cheeraratana C，Sasithon P，et al.SDS-PAGE analysis of whole cell protein and outer membrane protein patterns of clinical isolates ofBurkholderia pseudomallei[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine，2009，2（5）：14-19.

[15]G.dimov S，Stoyanova S，Kirilkov N，et al.Molecular typing oflactobacilliisolated from dry sausage“lukanka”：comparison ofwhole cell protein versus DNA-BASEDmethods[J].Biotechnol，2010（5）：598-599.

[16]Vanier L C，Jose M P，Richard R，et al.Analysis of electrophoretic whole cell protein profiles as a tool for characterization ofenterococcusspecies[J].CurrentMicrobiology，1994，28：149-153.

[17]余勃，陸兆新.AFLP技術在食品微生物研究中的應用田[J].食品與發酵工業，2002，29（3）：75-78.

[18]Fatima G，Djamal E H，Zineb B，etal.Phenotypic and whole cell protein analysis by SDS-PAGE for identification ofdominants lactic acid bacteria isolated from Algerian raw milk[J].World Journal of Dairy&Food Sciences，2009，4（1）：78-87.

Whole cell protein analysis by SDS-PAGE ofStreptococcus thermophilusisolated from different Direct Vat Set

XU Ai-cai，MA Cheng-jie，DU Zhao-ping，HUA Bao-zhen
（State Key Laboratory of Dairy Biotechnology，Technology Center of Bright Dairy&Food Co.，Ltd.，Shanghai200436，China）

Seven strains of Strep tococcus thermophilus were isolated from d ifferent Direct Vat Set（DVS）by using M17 agar medium.Then，the method of whole cell p rotein extracts was studied，the whole cell p rotein was analyzed by sod ium dodecyl sulfate polyacrylam ide gel electrophoresis（SDS-PAGE）.With the software of GelCom par 4.0，the p rotein sim ilarity coefficient of each two strains were obtained w ith tackled of whole cell p rotein patterns bands，the result showed that each strain had a unique and d istinguishab le whole cell p rotein p rofiles，analysised ofwhole cell p rotein p rofiles for identification could reach the levelw ithin specie of different strains.

lac tic acid bacteria；whole cellp rotein electrophoresis；c luster analysis

Q939.11+7

A

1002-0306（2012）14-0132-04

2011－12－01

徐愛才（1985-），男，碩士，研究員，主要從事乳品微生物方面的研究。

國家科技部973計劃（2010CB735705）。