溶氧對淀粉液化芽孢桿菌BS 5582產β-葡聚糖酶的影響

劉澤慧，李永仙，李 崎，*

（1.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122；2.江南大學生物工程學院釀酒科學與工程研究室，江蘇無錫 214122）

溶氧對淀粉液化芽孢桿菌BS 5582產β-葡聚糖酶的影響

劉澤慧1，2，李永仙1，2，李 崎1，2，*

（1.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122；2.江南大學生物工程學院釀酒科學與工程研究室，江蘇無錫 214122）

淀粉液化芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BS 5582在10L全自動發酵罐規模生產β-葡聚糖酶，分別控制通氣量、罐壓和攪拌轉速進行溶氧優化，研究發現在裝液量6L，接種量6.67%，發酵溫度37℃的條件下，優化后通氣量9L/min，攪拌轉速600r/min，罐壓0.6MPa，β-葡聚糖酶酶活在44h達到511U/mL，比優化前提高了122.76%。

淀粉液化芽孢桿菌，β-葡聚糖酶，溶氧，優化

β-葡聚糖是一種非淀粉性多糖，廣泛存在于植物和微生物的細胞壁中，是由葡萄糖以混合的β-1，3和β-1，4糖苷鍵連接而成的D型葡萄糖聚合物[l-2]。β-1，3-1，4葡聚糖酶（EC 3.2.1.73），簡稱β-葡聚糖酶，能夠高效、專一分解植物來源的β-葡聚糖中β-1，3和β-1，4混合的糖苷鍵，使大分子β-葡聚糖不斷降解。其主要用途：一是應用于啤酒生產，可解決因大麥中β-葡聚糖引起的麥汁粘度過大、過濾困難、麥汁得率低、影響啤酒穩定性等問題[3-5]；二是作為飼料添加劑，消除谷物中β-葡聚糖在家禽家畜腸道內產生的粘性抗營養因子影響，提高飼料利用率[6]。目前，β-葡聚糖酶在啤酒生產和飼料行業應用十分廣泛，所以提高β-葡聚糖酶的產量成為眾多研究者的目標。目前報道的產β-葡聚糖酶的菌種有細菌[7-8]、真菌[9-11]、放線菌[12]等，作者所在研究室保藏的產β-葡聚糖酶專利菌種Bacillus amyloliquefaciensBS 5582在前期搖瓶實驗中也得到了較高酶活[13-14]。淀粉液化芽孢桿菌發酵過程屬于好氧發酵，發酵液溶氧過低會抑制菌體的生長代謝從而不利于產酶，而發酵液溶氧過高，會導致菌體生長過快，營養物質提前耗盡，也不利于產酶。所以適宜的溶氧條件是提高β-葡聚糖酶產量的重要因素，通氣量、罐壓、攪拌、罐體形狀等共同決定了發酵罐的供氧狀況和溶氧水平，實驗和生產中通常通過控制通氣量、罐壓和攪拌轉速來控制適宜的發酵液溶氧水平。本研究對該菌產β-葡聚糖酶在10L發酵罐中通氣量、罐壓和攪拌轉速進行摸索，為后續研究和工業化生產提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

Bacillus amyloliquefaciensBS 5582 本研究室保藏菌株；AZO藍色大麥葡聚糖 Megazyme公司；種子培養基（g/L） 蛋白胨10，牛肉膏5，氯化鈉5；pH 7.0，121℃滅菌15min；斜面培養基 另加瓊脂20g/L；發酵培養基（g/L） 玉米粉40，豆餅粉40，大麥粉20，Na2HPO412，（NH4）2SO44，CaCl20.75，MgSO41。

Biostat C10-3發酵罐 德國B.Braun Biotech international公司，工作容積10L，高徑比3∶1，上攪拌，原位滅菌，可在線檢測溫度、轉速、pH、OD、通氣量、罐壓等；SBA-40C型生物傳感雙功能分析儀 山東省科學院生物研究所；UV-2000紫外分光光度計 上海優尼科儀器有限公司。

1.2 菌種培養方法

1.2.1 斜面活化和種子培養 將冰箱中保藏的菌種接種到斜面培養基，37℃靜置培養24h；活化后斜面菌種按每瓶3環接種到裝有200m L種子培養基500m L三角瓶中，37℃下以200r/m in轉速振蕩培養14h。

1.2.2 發酵培養 發酵罐裝液量6L，接種量6.67%，溫度37℃，攪拌轉速500r/m in，通氣量6L/m in，罐壓0.2MPa，自然pH，加泡劑6m L，發酵12h后開始每隔4h取樣測定發酵液酶活，總糖。

1.3 酶活測定方法

改良AZO方法：0.1m L經適當稀釋的酶液，加入經40℃預熱的藍色葡聚糖底物（使用前和0.02mol/L的pH6.5的磷酸緩沖液等體積混合），在40℃反應10min，每個反應樣品中加入3.0m L沉淀液，搖勻后10000r/m in離心5m in，1cm的比色杯測定清液在590nm處的吸光值，以0.1m L的去離子水代替酶樣品做空白對照。每個樣品做3個平行樣。酶活計算公式如下：

β-葡聚糖酶酶活（U/m L）=稀釋倍數×（OD+0.0558）/（0.0012×180）

其中，180為底物分子量，0.0558和0.0012為標準曲線回歸的數據。

酶活定義：單位體積酶液在40℃和pH為6.5條件下，每分鐘水解β-葡聚糖生成相當于1μmol的葡萄糖還原物質的量為1個酶活力單位，以U/m L表示。

1.4 總糖測定方法

利用SBA-40C型系列生物傳感雙功能分析儀，依據酶促反應來定量，可直接在顯示屏上讀出底物濃度，計算公式如下：

存在于我國大部分企業中的，阻礙其基層黨建政工工作開展的一個重要影響因素，就是企業不論是管理人員還是員工，都沒有從源頭上給予黨建政工工作足夠的重視度，這就導致了企業上下對黨建政工工作從思想上的漠視?，F如今，隨著我國經濟市場的規模不斷擴大、發展形式更加多樣化，存在于我國企業中的競爭變得更加激烈，而企業內部基層黨建政工工作是否有一個良好的開展，也是企業綜合競爭力的其中一部分，其重要性是毋庸置疑的。

總糖（g/L）=讀數×稀釋倍數/100

2 結果與分析

2.1 通氣量對產酶的影響

淀粉液化芽孢桿菌發酵生產葡聚糖酶屬于好氧發酵，而通氣量是影響發酵液溶氧濃度的重要條件，通氣量太小會導致溶氧濃度過低影響菌體生長代謝和產酶，通氣量太大會增加培養基水分的蒸發，增加能耗和生產成本。實驗考查了不同通氣量條件（6、9、12L/m in）下發酵液中總糖含量和菌體產酶的變化，以6L/min為對照罐，結果見圖1所示。

圖1 通氣量對產酶的影響Fig.1 The effectof ventilation onβ-glucanase fermentation

由圖1可知，不同通氣量對發酵液中總糖的消耗并無太大影響，在發酵初期都有較快的總糖消耗，并在24h下降到10g/L左右并穩定在10g/L左右。增加通氣量后發酵液的酶活明顯高于對照罐，9L/m in罐最高酶活出現在44h為390.1U/m L，12L/min罐最高酶活出現在48h為394.7U/m L，高于對照罐48h的最高酶活229.4U/m L。表明增加通氣量并沒有加快菌體對總糖的消耗，且發酵液中的糖在發酵前期就下降到較低水平，可能會成為后期菌體生長產酶的限制性因素。通氣量增加到9L/m in可以提高發酵液酶活70.1%，但增加通氣量到12L/m in發酵液酶活幾乎沒有提高，說明9L/m in的通氣量已經可以滿足菌體生長代謝需要或者已經達到最大臨界通氣量，再單純增加通氣量不能提高菌體對葡聚糖酶的生產。而12L/m in通氣量使發酵液水分蒸發很大，醪液粘稠起泡，控制困難，所以后期實驗選擇通氣量9L/m in。

2.2 罐壓對產酶的影響

發酵罐罐壓是影響發酵液溶氧濃度的另一重要條件，其他條件恒定增大罐壓可以提高發酵液溶氧水平，但同時也會抑制氣體性代謝產物的排出，增加發酵液中某些抑制物的濃度，從而影響菌體的生長代謝，罐壓的提高還會提高對設備的要求，增加生產風險。前期實驗在較低罐壓下提高通氣量已經無法提高溶氧水平，所以恒定9L/min通氣量，考察罐壓對酶產量的影響，分別取罐壓為0.2、0.4、0.6和0.8MPa，以0.2MPa為對照罐，結果見圖2。

圖2 罐壓對產酶的影響Fig.2 The effect of pressure onβ-glucanase fermentation

由圖2可知，不同罐壓發酵罐的總糖消耗差別依然不大，0.6MPa罐在發酵前中期總糖消耗比其他罐略快，0.4MPa罐和0.8MPa罐次之，對照罐發酵液糖分消耗略慢于其他三罐。三個優化罐在24h后總糖穩定在8g/L左右，對照罐穩定在10g/L左右。隨著罐壓的增加，β-葡聚糖酶活力先升高后下降，在罐壓為0.6MPa時酶活最高，達到509.5U/m L，分別比對照罐、罐壓0.4MPa和0.8MPa的發酵酶活提高37%、17%和29%。同時最高酶活均出現在發酵44~48h左右。結果表明，在罐壓較低時增大罐壓可以明顯促進菌體產酶，當罐壓達到一定值時繼續提高罐壓可能會導致某些代謝產物無法及時排出，增加發酵液中某些產物的濃度而反饋抑制菌體產酶，0.6MPa的罐壓為最適罐壓，最大酶活比對照罐提高37%。

2.3 攪拌轉速對產酶的影響

攪拌、通氣量、罐壓、空氣壓力等共同決定了發酵罐的供氧狀況和溶氧水平，在空氣壓力和攪拌類型不變時，通過調節攪拌轉速、通氣量和罐壓可以控制發酵液的溶氧濃度，保證菌體正常的代謝。根據前期實驗恒定通氣量為9L/m in，罐壓為0.6MPa，考察攪拌轉速對產酶的影響，分別取轉速為400、500、600r/m in，結果見圖3所示。

圖3 攪拌轉速對產酶的影響Fig.3 The effect of stirring speed onβ-glucanase fermentation

由圖3可知，600和500r/min罐發酵液總糖在發酵前期下降速度略快于400r/m in罐，但三者差別不大，總糖濃度都在24h后穩定在8g/L左右。從酶活曲線可以看出，隨著攪拌轉速的增加，發酵前中期β-葡聚糖酶酶活增長速度加快，600r/m in罐在44h達到最高酶活511U/m L，500r/m in罐在48h達到最高酶活509.5U/m L，400r/m in罐在52h達到最高酶活470U/m L。表明總糖消耗情況在不同轉速下差別不大，轉速由400r/m in提高到500r/m in，有利于菌體產酶，縮短發酵周期；而轉速繼續提高到600r/m in，最高酶活幾乎沒有提高，僅能小幅縮短發酵周期。

2.4 優化前后菌體產酶比較

經過實驗優化后通氣量、罐壓和攪拌轉速分別為9L/min、0.6MPa和600r/min，經驗證實驗得出優化后β-葡聚糖酶在發酵44h最高酶活達到511U/min，相對于優化前發酵48h最高酶活229.4U/m L，發酵周期縮短4h，β-葡聚糖酶酶活提高122.76%。

3 結論

發酵液溶氧是影響菌體生長代謝的重要因素，溶氧的優化旨在找到各種影響發酵液溶氧狀態的發酵條件的最適值，最大化的提高生產效率。本研究從通氣量、罐壓、攪拌轉速三個方面對發酵液溶氧的控制條件進行優化，得出適宜的控制條件，通氣量9L/m in，罐壓0.6MPa，攪拌轉速600r/min。β-葡聚糖酶酶活在44h達到511U/m L，比初始發酵提高了122.76%，綜上所述，發酵條件優化后菌體產酶量提高非常顯著，達到了預期的效果。

[1]He GQ，TANGXJ，Mukhtar A M，etal.Optimization of cultural conditions for thermostable，β-1，3-1，4-glucanase production byBacillus subtilisZJF-1AS[J].Zhejiang U Sci，2003（11）：719-725.

[2]鄒東恢，江潔.β-葡聚糖酶的開發與應用研究[J].農產品加工·學刊，2005（8）：7-9.

[3]Scott RW.The viscosity of worts in relation to their content ofβ-glucan[J].J Inst Brew，1972，78：179-186.

[4]周光勇，油松濱.啤酒中β-葡聚糖的研究[J].啤酒科技，2004（2）：15-16.

[5]尹象勝，李永仙，顧國賢，等.啤酒釀造用復合酶的研制[J].無錫輕工大學學報，1994，13（4）：300-309.

[6]王圓，朱海東.細菌產β-1，3-1，4-葡聚糖酶的結構、功能及應用的研究進展[J].飼料工業，2005，26（2）：18-20.

[7]Hong TY，MengM.Biochemicalcharacterizationand antifungal activity ofan endo-1，3-β-glucanase ofPaenibacillussp.Isolated from garden soil[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2003，61：472-478.

[8]Miyanishi N，Hamada N，Kobayashi T，et al.Purification and characterization of a novel extracellular beta-1，3-glucanase produced byBacillus clausiiNM-1 isolated from ezo abalone Haliotisdiscushannai[J].JournalofBiosicenceand Bioengineering，2003，95（1）：45-51.

[9]Nguyen H H，Graham H F.Separation and characterization of six（1→3）-β-Glucanases from Saccharomyces serevisiae[J]. Journal of Bacteriology，1983，156（3）：1204-1213.

[10]Anna A K，Karl K T，Konstantin A S，etal.Isolation，enzymatic properties，and mode of action of an exo-1，3-β-glucanaseTrochoderma viride[J].European Journal of Biochemistry，2001，268：6123-6131.

[11]Fontaine T，Hartland R P，Beauvais A，et al.Purification and characterization of an endo-1，3-β-glucanase from aspergillus fumigatus[J].European JournalofBiochemistry，1997，243：315-321.

[12]Tiunova N A，Kobzeva N Ia，Zaikina I V，et al.1，3-beta-Glucanases ofActionmycetes[J].Mikrobiologiia，1983，52（4）：586-590.

[13]郝秋娟，李永仙，李崎.淀粉液化芽孢桿菌產β-葡聚糖酶培養基優化以及酶穩定劑的研究[J].中國釀造，2006（4）：18-22.

[14]郝秋娟，李永仙，李崎，等.溫度對淀粉液化芽孢桿菌5582產β-葡聚糖酶的影響[J].中國釀造，2007（3）：11-15.

Effect of dissolved oxygen onβ-glucanase fermentation byBacillus am yloliquefaciensBS 5582

LIU Ze-hui1，2，LIYong-xian1，2，LIQi1，2，*
（1.The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi214122，China；2.Laboratory of Brewing Science and Technology，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

The fermentation conditions ofBacillus am yloliquefaciensBS5582 were investigated in 10L automatic fermenter to im p roveβ-g lucanase p roduc tion.Dissolved oxygen concentration was op tim ized by controlling ventilation，p ressure and stirring speed.The enzyme ac tivity ofβ-g lucanase was 511U/m L in 44h，inc reased by 122.76%.The op tim ized cond ition was determ ined as follows：37℃，inoculation amount 6.67%，liquid volume 6L，ventilation amount9L/m in，stirring speed 600r/m in，tank p ressure 0.6MPa.

Bacillus amyloliquefaciens；β-g lucanase；d issolved oxygen；op tim ization

TS201.3

A

1002-0306（2012）14-0173-03

2011－10－27 *通訊聯系人

劉澤慧（1985-），女，碩士研究生，主要從事發酵工程的研究。

國家創新基金（09C26213203751）；教育部新世紀人才支持計劃（NCET-0453）；江蘇省創新基金（BC2009291）；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目（PAPD）。