補加氨水對薛氏丙酸桿菌分批發酵及代謝物抑菌活性的影響

王曉云，金風杰，計芬芬，常忠義，高紅亮，*

（1.華東師范大學生命科學學院，上海 200062；2.上海市紡織科學研究院，上海 200082）

補加氨水對薛氏丙酸桿菌分批發酵及代謝物抑菌活性的影響

王曉云1，金風杰1，計芬芬2，常忠義1，高紅亮1，*

（1.華東師范大學生命科學學院，上海 200062；2.上海市紡織科學研究院，上海 200082）

研究了在分批發酵過程中補加氨水對1株薛氏丙酸桿菌（Propionibacterium shermanii）發酵及其代謝物對惡臭假單胞菌（Pseudomonas pudia）抑菌活性的影響。結果表明，薛氏丙酸桿菌代謝物在初始pH7.0時抑菌活性最高，為7.59AU/mL，顯著高于其他實驗組（p＜0.05）；每隔24h補加10%氨水溶液調節發酵液pH6.0時，薛氏丙酸桿菌的生物量和代謝物的抑菌活性都最大，分別為9.62mg/mL和16.42AU/mL；研究分別從第2、3或4d補加10%氨水開始調節發酵液pH6.0時發現，從發酵第2d開始調節pH效果最好，生物量和代謝物的抑菌活性分別達到9.55mg/mL和16.47AU/mL。這些結果表明，在分批發酵過程中補加氨水調節發酵液的pH可以顯著提高丙酸桿菌代謝物的抑菌活性。

薛氏丙酸桿菌（Propionibacterium.shermanii），氨水，抑菌活性

目前食品工業常用的防腐劑主要有苯甲酸鈉和山梨酸鉀等。然而越來越多的研究表明山梨酸鉀等化學合成防腐劑對人體都有潛在的毒副作用[1-2]。細菌素作為一種天然的防腐劑開始引起人們的關注。它是一種多肽，進入人體的消化道后，可以被消化道內的各種蛋白酶消化掉[3]。與常用的化學防腐劑相比，具有無毒、無副作用、無殘留、無抗藥性的優點，并可以抑制或殺死一些食品腐敗菌[4]。目前研究最多的細菌素是乳酸鏈球菌素（Nisin）[5]，作為天然微生物防腐劑已被多個國家批準使用，其對革蘭氏陽性菌有較強的抑制作用，對革蘭氏陰性菌、酵母和霉菌則沒有明顯的抑制作用[6]。丙酸桿菌素卻有廣泛的抑菌作用，不僅能抑制革蘭氏陰性細菌、部分革蘭氏陽性菌、霉菌和酵母的生長[7]，且它是由乳品丙酸桿菌代謝產生，符合現代綠色食品無毒副作用的要求，因而作為食品防腐劑具有很大的潛力。國外已經報道的丙酸桿菌素有5種[8]，即丙酸桿菌素PLG-1、丙酸桿菌素G、丙酸桿菌素T1、丙酸桿菌素JenseniiG和丙酸桿菌素SM 1。法國羅地亞公司開發的一種新型生物防腐劑MicrogardTM[9-10]，已被美國醫藥和食品管理局（FDA）批準為防腐劑用于食品中，而M icrogardTM是謝氏丙酸桿菌的發酵代謝物。近年來國內在對丙酸桿菌進行菌種分離、鑒定與產酸的基礎上也開始對其發酵條件[3，11-12]進行初步探索，包括碳源、氮源的選擇，補料對發酵的影響等，馬悅培[13]等人還對發酵環境的pH影響進行了一定的研究，然而對于用堿液調節pH對丙酸桿菌發酵的影響還尚無報道。氨水相對于發酵上較常見的氫氧化鈉、碳酸鈣等調節pH有三方面的優勢：一是氨水屬于弱堿，可以形成一個緩沖調節體系，二是在一定程度上可以提供氮源，三是不易形成沉淀。本文即主要研究補加氨水調節pH對丙酸桿菌分批發酵過程的影響，研究了在補加10%氨水調節不同pH的條件下丙酸桿菌的生長及代謝物的抑菌活性，為以后的研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

薛氏丙酸桿菌（Propionibacterium shermanii） 本實驗室分離并保存；惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida） 上海疾病控制防疫中心；惡臭假單胞菌培養基，LB培養基；氨水、苯酚、NaHSO3、酒石酸鉀鈉、3，5-二硝基水楊酸、酒石酸、NaOH 均為分析純；丙酸桿菌種子培養基是SLB培養基[11]胰蛋白胨10g，酵母提取物10g，60%乳酸鈉16.7m L，K2HPO40.25g，MnSO40.005g，加蒸餾水定容至1000m L，pH 7.0；丙酸桿菌發酵培養基是葡萄糖培養基 用2%的葡萄糖代替SLB中的乳酸鈉，其它成分不變。

TDL-5型高速離心機，96孔聚苯乙烯酶標板，酶標檢測儀（power wave xs）。

1.2 實驗方法

1.2.1 指示菌的制備 活化的惡臭假單胞菌按1.0%的接種量接種于LB培養基中，37℃，200r/m in搖床振蕩培養過夜至OD600nm為0.2，再用無菌的LB培養基稀釋100倍備用。

1.2.2 丙酸桿菌的培養及其代謝物的制備 將丙酸桿菌接入種子培養基，32℃靜置培養48h作為種子液，按10%的接種量接入裝有發酵培養基的150m L錐形瓶中，32℃靜置培養，每隔24h取樣一次。所取樣品于8000r/min冷凍離心15min取上清液，測定pH后用10%的NaOH溶液調pH至7.0，再用10%的酒石酸調至pH 5.3，最后進行膜（0.22μm）過濾除菌，置于4℃冰箱中保存。

1.2.3 補加氨水方法 a.不同初始pH對丙酸桿菌發酵的影響 分別設定發酵培養基的初始pH為6.5、7.0、7.5和8.0時進行發酵，以確定丙酸桿菌代謝物最大抑菌活性的最佳初始pH。

b.補加氨水調節不同的pH 從第2d開始起間隔24h補加10%氨水調節發酵過程的pH分別為5.5、6.0和6.5，研究其對丙酸桿菌發酵及其代謝物抑菌活性的影響。以初始pH為7.0未補加氨水的發酵作為對照。

c.不同補加氨水時間對丙酸桿菌發酵的影響 選擇分別在發酵后的第2、3和4d開始間隔24h補加氨水調節發酵液pH6.0，研究不同補加時間對發酵的影響。

1.2.4 丙酸桿菌代謝物抑菌活性（AU）測定 采用改良的系列稀釋法[14]，測定丙酸桿菌代謝物抑菌活性，其中將丙酸桿菌代謝物用LB培養基（滅菌后用10%的酒石酸調pH 5.3）以2N逐步稀釋。制備酶標板時每孔中加入20μL不同稀釋度的丙酸桿菌代謝物和180μL上述指示菌液，以空白的20μL LB培養基和180μL上述指示菌液做對照，每個稀釋度的樣品做三個平行，37℃培養箱中靜置培養24h。抑菌活力的計算：在酶標檢測儀上讀數測定每孔的OD600nm，OD值為對照值一半時代謝物的稀釋度為一個抑菌活性單位（AU）。

1.2.5 還原糖含量的測定 采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法[15]。

1.2.6 生物量的測定 取丙酸桿菌發酵液50m L于8000r/m in離心15m in，沉淀用去離子水沖洗3次，105℃烘干至恒重后稱取質量。

2 結果與分析

2.1 不同初始pH對丙酸桿菌發酵的影響

圖1 不同初始pH下發酵液的pH變化Fig.1 The pH value of the fermentation brothswith different initialmedium pH

各處理組發酵液的pH在第1、2d下降很快（圖1），pH均在第2d達到5左右，此后各處理組pH趨勢相同，表明不同初始pH對發酵后期的pH影響不大。

圖2 不同初始pH代謝物抑菌活性的變化Fig.2 Antimicrobial activity of themetaboliteswith different initialmedium pH

初始pH對代謝物抑菌活性有很大影響，如圖2顯示了不同初始pH發酵產生的丙酸桿菌代謝物對惡臭假單胞菌的抑菌活性。初始pH 7.0、7.5和8.0時，抑菌活性均在第7d達到最大值，其中初始pH7.0時的抑菌活性最大，為7.59AU/m L，和其他實驗組差異顯著（p＜0.05）。因此，丙酸桿菌發酵的最優初始pH為7.0。

2.2 補加氨水對丙酸桿菌發酵的影響

如圖3所示，補加10%氨水調節發酵液pH為6.0和6.5發酵所得的菌體生物量明顯增加，且生物量在第5d出現最大值，pH為6.0的實驗組為9.62mg/m L，極顯著高于對照組的（p＜0.01），但是和pH為6.5的實驗組差異不顯著。這一結果表明pH維持在6.0和6.5之間明顯有利于丙酸桿菌菌體生長。

圖3 補加10%氨水溶液調節不同pH時發酵液生物量的變化Fig.3 Biomass of P.shermanii by feeding ammoniawater to adjust pH of broth

根據圖4可以看出，補加10%氨水調節pH為6.0和6.5的實驗組還原糖消耗很快，在第5d分別僅有1.41和2.55mg/m L，和對照組差異極顯著（p＜0.01）。這與圖3的結果相吻合，表明菌體生長消耗了大量的還原糖。

圖4 補加10%氨水溶液調節不同pH時發酵液還原糖的變化Fig.4 Reducing sugar of P.shermanii by feeding ammoniawater to adjust pH of broth

如圖5所示，用10%氨水調節發酵液不同pH，丙酸桿菌代謝物的抑菌活性有明顯差異。實驗組最大抑菌活性值均出現在第5d，比對照組早兩天，且抑菌活性都明顯高于對照組。其中pH為6.0的實驗組在第5d達到最大值，為16.42AU/m L，抑菌活性與對照組的最大抑菌活性（發酵第7d）相比差異極顯著（p＜0.01），與其他實驗組相比也差異顯著（p＜0.05）。因此，用10%氨水溶液調節丙酸桿菌發酵液pH 6.0效果是發酵代謝物的最優pH。

圖5 補加10%氨水溶液調節不同pH時代謝物抑菌活性的變化Fig.5 Antimicrobial activity of P.shermanii by feeding ammoniawater to adjust pH of broth

2.3 不同補加氨水時間對丙酸桿菌發酵的影響

由圖6可以看出，發酵第2d開始調節pH，生物量在第5d達到最大值，為9.55mg/m L，極顯著高于對照組最高值4.94mg/m L（發酵第6d，p＜0.01），其余實驗組與對照組則在發酵第6d達到生物量最大值。

圖6 不同時間補加氨水時發酵液生物量的變化Fig.6 Biomassof P.shermanii by feeding ammoniawater in different time

由圖7可以看出，發酵第2d用氨水調節pH的實驗組還原糖在第5d濃度已經很低，為1.31mg/m L，其余各實驗組還原糖在第6d也基本利用完。這和圖6的生物量的實驗結果也比較相似。

圖7 不同時間補加氨水時還原糖的變化Fig.7 Reducing sugarby feedingammoniawater in different time

發酵第2d用氨水調節pH的實驗組抑菌活性最高，第5d的抑菌活性為16.47AU/m L，極顯著高于對照組和其他實驗組（p＜0.01）（圖8）。由此可見，從發酵第2d用氨水調節pH為6.0的發酵方式最好，不僅可以縮短發酵時間，還可以極顯著地提高抑菌活性。

圖8 不同時間下補加氨水時代謝物抑菌活性的變化Fig.8 Antimicrobialactivity of P.shermanii by feeding ammoniawater in different time

3 結論與討論

薛氏丙酸桿菌在初始pH為7.0時發酵產生的代謝物抑菌活性最高，為7.59AU/m L，顯著高于其他實驗組；當補加10%氨水調節pH為6.0時，薛氏丙酸桿菌的生物量和代謝物的抑菌活性都最大，分別為9.62mg/m L和16.42AU/m L；不同的氨水補加時間表明，從發酵第2d開始每隔24h調節pH為6.0時效果最好，生物量和代謝物的抑菌活性分別達到9.55mg/m L和16.47AU/m L，其中抑菌活性在第5d就達到了最大值，且極顯著高于對照組和其他實驗組的最大值（其他組第6d達到最大值，p＜0.01）。

由此可見，發酵第2d每隔24h補加10%氨水調節pH為6.0的發酵方式最好，不僅可以縮短發酵時間，還可以極顯著地提高抑菌活性。

目前進行的丙酸桿菌發酵均是分批發酵，所以每次發酵在目標產物開始出現并積累時，培養基中已經積累了大量的生長限制因子和產物合成限制因子，如發酵產物乙酸、丙酸等有機酸，從而抑制了發酵液中菌體的生長和具有抑菌效價的丙酸桿菌代謝物的合成，為了增加發酵所得丙酸桿菌代謝物的抑菌效價，需要有效調節發酵液的pH，本實驗首次用氨水對發酵液的pH進行了調節，顯著提高了丙酸桿菌代謝物的抑菌活性，使其向工業化生產又邁進了一步。

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Study on fermentation and metabolites antim icrobialactivity of Propionibacterium shermanii by feeding ammonia

WANG Xiao-yun1，JIN Feng-jie1，JIFen-fen2，CHANG Zhong-yi1，GAO Hong-liang1，*
（1.School of Life Sciences，East China Normal University，Shanghai200062，China；2.Shanghai Textile Research Institute，Shanghai200082，China）

The fed-batch culture p rocess and the antim icrobial activity ofmetabolites from Propionibacterium. shermanii against Pseudomonas.putida by feed ing ammonia water were studied.The results showed that the activity ofmetabolites was 7.59AU/m L，when the initialmedium was pH 7.0，and the antim icrobial activity was remarkab le higher than that of other g roups（p＜0.05）.When feeding 10%ammonia water to ad just pH of broth to 6.0，the biomass of P.shermanii was 9.62mg/m L，and the antim icrobialactivity ofmetabolites was 16.42AU/m L. both of them were the highest among all the treatments.The pH of broth was ad just to 6.0 w ith 10%ammonia water begin w ith 2，3 and 4d，respectively.Maximalmetabolites antim ic robialactivity（16.47AU/m L）and maximal biomass（9.55mg/m L）were observed，when ad just pH w ith 10%ammonia water begin w ith 2d.It could remarkab ly im p rove the antim icrobial activity ofmetabolites from P.Shermanii against P.putida when feed ing 10%ammonia water to ad just pH of b roth in the batch-culture.

Prop ionibacterium Shermanii；ammonia water；antim icrobialactivity

TS201.3

A

1002-0306（2012）14-0224-04

2011－11－17 *通訊聯系人

王曉云（1987-），女，在讀碩士，研究方向：食品微生物。

上海市農業遺傳育種重點實驗室開放基金項目（Shagb2009-02）。