馬鈴薯淀粉廢水中蛋白質的提取研究

任瓊瓊，陳麗清，韓佳冬，張宇昊，2，*，馬 良，2

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400716；2.重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400716）

馬鈴薯淀粉廢水中蛋白質的提取研究

任瓊瓊1，陳麗清1，韓佳冬1，張宇昊1，2，*，馬 良1，2

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400716；2.重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400716）

實驗采用堿提酸沉法與超濾相結合從馬鈴薯淀粉廢水中提取蛋白質。通過單因素實驗和響應曲面法優化堿提酸沉工藝，結果表明，堿提酸沉法提取馬鈴薯淀粉廢水蛋白質的最佳工藝參數為：堿提pH9.35，堿提時間59min，酸沉pH3.41，酸沉時間10min。在此條件下蛋白質提取率可達54.24%。酸沉液采用10ku超濾膜進一步提取蛋白，最終總提取率可達93.42%。

馬鈴薯淀粉廢水，堿提酸沉，超濾，蛋白質

馬鈴薯蛋白是良好的蛋白質來源，將馬鈴薯淀粉廢水中的蛋白質提取再利用不僅可以改善環境，而且能夠回收一定的粗蛋白，提高馬鈴薯淀粉生產的附加值。目前有報道稱可采用磁性殼聚糖微球吸附以及臭氧鼓泡等新型的方法回收馬鈴薯淀粉廢水中的蛋白質。所謂磁性殼聚糖是指內部含有磁性金屬或金屬氧化物（鐵、鈷、鎳及其氧化物）的超細粉末且具有磁響應性的殼聚糖微球，其中含有重金屬物質，因此回收蛋白質的安全性等需進一步驗證。傳統提取蛋白質的方法主要有：加熱法、加酸法、絮凝沉淀法以及超濾法。加熱提取蛋白的提取率達到了75%左右，但是加熱使蛋白產生不可逆沉淀，對蛋白質品質影響很大；加酸提取蛋白的得率可達40%；絮凝法對廢水的COD去除率較高，但是對蛋白質的回收率卻很低。目前，國內采用膜技術回收馬鈴薯淀粉廢水中蛋白質的研究很少，僅有少數的實驗室研究報道[1]。廢液直接用于超濾不僅對膜造成很大的壓力，影響膜的壽命；而且經濟效益較低。本研究首先采用堿提酸沉提取廢液蛋白質，在此基礎上結合超濾進一步提取蛋白，以期在有效減輕直接超濾對膜造成損耗的前提下，充分提取廢液中的蛋白質。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

考馬斯亮藍 成都科龍化工試劑廠；氫氧化鈉，鹽酸，亞硫酸氫鈉。

752紫外可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；QL-901漩漩渦震蕩儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；PHS-25型數顯酸度計 雷磁分析儀器廠；JA 2003A、JA50002電子分析天平 上海精天；101型電熱鼓風恒溫干燥箱 余姚金惠電子設備廠；CMSC300超濾杯 上海摩速科學器材有限公司；entrifuge 5810型高速離心機，JYL-C022型九陽料理機。

1.2 實驗方法

1.2.1 淀粉廢水的制備 將馬鈴薯切碎后用打漿機絞碎，加水（1∶4）、1%亞硫酸氫鈉攪拌10min，再靜置15m in，用雙層濾布過濾，濾液靜置2h后，在6000r/m in轉速下離心10m in，取上清液作為實驗水樣。在攪拌過程中加入亞硫酸氫鈉的目的是防止水樣褐變[2]。

1.2.2 堿提酸沉法提取馬鈴薯淀粉廢水蛋白 淀粉廢水→堿液提取→6000r/min離心→調酸沉淀→8000r/min離心取上清液→堿液提取→6000r/min離心→調酸沉淀→8000r/min離心→蛋白質沉淀→冷凍干燥→粗蛋白粉

1.2.3 堿提酸沉法提取馬鈴薯廢水蛋白的單因素實驗設計 以蛋白質的提取率為指標評價堿提酸沉法提取馬鈴薯廢水蛋白的效果，單因素實驗的基本條件定為：堿提pH為8.0，提取時間為60min，酸沉pH為4.5，酸沉時間為10m in。改變其中一個條件，固定其他條件以分析堿提pH、堿提時間、酸沉pH、酸沉時間對蛋白提取率的影響。各因素梯度分別為：堿提pH：7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10；堿提時間：1、5、30、60、120m in；酸沉pH：2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5；酸沉時間：5、10、20、30、40m in。每個因素重復實驗3次，結果取平均值。對上清液進行二次堿提酸沉后，測上清液蛋白質含量。

1.2.4 三因素二次回歸正交旋轉實驗設計 根據單因素實驗結果，選取了三個主要影響因子：堿提pH、堿提時間、酸沉pH。再按中心組合實驗設計方法設計三因素三水平共23組實驗的實驗方案。實驗因素水平和編碼如表1所示。

表1 三因素三水平實驗設計Table 1 Factors and levels for the experiment

1.2.5 酸沉上清液中蛋白超濾提取 使用10ku聚砜膜在壓強0.12~0.15MPa、溫度25℃的條件下對酸沉上清液進行超濾，采用考馬斯亮藍法測定超濾濃縮液的蛋白質含量，并以蛋白質回收率為指標進行評價。

1.2.6 蛋白質含量的測定 溶液中蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍法[3]。在595nm波長下進行比色，以牛血清白蛋白濃度1g/L為標準液，繪制標準曲線，然后測定各樣品。蛋白提取率按以下公式計算。

蛋白提取率（%）=（提取后上清液蛋白含量/原液蛋白含量）×100

2 結果與討論

2.1 堿提酸沉法提取馬鈴薯廢水蛋白的單因素實驗

2.1.1 堿提pH對蛋白質提取率的影響 由圖1得知，在pH7~9.5范圍內蛋白質的提取率總體呈現上升趨勢，pH 9.5時達到51.95%±0.029%，隨著pH進一步上升，提取率的增加不顯著。堿性條件可增溶蛋白的原因主要在于增加了蛋白負電荷的攜帶量，使維系蛋白在溶液體系的平衡力加強。由實驗結果可見，當pH在7~9.5范圍內時，蛋白負電荷攜帶量隨著pH的增加而增加，蛋白溶解性增加。pH大于9.5時，隨著pH的進一步增加，蛋白的電荷攜帶量因趨于飽和而不再明顯增加，蛋白得率也就不再明顯提高。此外，強堿條件下蛋白液的粘度增加，不僅不利于后續的離心分離，而且會造成蛋白質營養價值的降低[4]。綜合考慮以上因素，初步選取較適堿提pH為9.5。

圖1 堿提pH對蛋白質提取率的影響Fig.1 Effectof alkaliextraction pH on the extraction yield of protein

2.1.2 堿提時間對蛋白質提取率的影響 由圖2可知，隨著堿提時間的延長，蛋白質的提取率先上升后下降，在60m in時提取率最大，達到51.10%±0.052%。在一定時間范圍內，隨提取時間的延長，蛋白質的溶出率提高，蛋白質的提取率增大。由實驗結果得出，當提取時間達到60m in時，蛋白質的溶出達到了動態平衡，蛋白質的提取率達到了峰值，而隨著時間的進一步延長，廢水中的殘余淀粉可能與蛋白質結合，從而導致蛋白質難以溶出，提取率降低。因此，初步選取最適提取時間為60m in。

圖2 堿提時間對蛋白質提取率的影響Fig.2 Effectof alkaliextraction time on the extraction yield of protein

圖3 酸沉pH對蛋白質提取率的影響Fig.3 Effectof acid precipitation pH on the extraction yield of protein

2.1.3 酸沉pH對蛋白質提取率的影響 由圖3可知，在酸沉pH 2.5~3.5范圍內，蛋白提取率呈先上升后下降趨勢，且在pH 3.0時達到第一個峰值，提取率為50.76%±0.0040%，在pH3.5~5.5范圍內，蛋白質提取率同樣呈先上升后下降趨勢，且在pH 4.0時達到第二個峰值，提取率為50.95%±0.052%。等電點時蛋白質分子顆粒在溶液中不存在同電荷的相互排斥作用，其顆粒極易相互碰撞凝聚而沉淀析出，因此，此時溶液中蛋白質的溶解度最小。由實驗結果看出，酸沉過程中出現了兩個等電點，出現此情況的可能原因是由于堿提取導致多種蛋白組分同時溶出，而不同蛋白質有不同等電點[5]。綜合考慮各因素，初步選取較適酸沉pH為4.0左右。

2.1.4 酸沉時間對蛋白質提取率的影響 由圖4可以看出，蛋白質的提取率與酸沉時間的曲線呈先上升后下降的趨勢，在沉淀時間為20m in時達到峰值，此時蛋白質的提取率達到了48.26%±0.023%。蛋白質處于等電點時，呈絮狀沉淀物，此現象稱蛋白質的結絮作用。結絮作用所生成的絮狀物不穩定，隨著時間的延長，可再溶于溶液中。由實驗結果得知，在沉淀時間為20m in時，蛋白質的提取率達到了峰值，隨著時間進一步延長，結絮后的蛋白質可能再溶于溶液而導致提取率降低。與其他影響因素相比，酸沉時間研究范圍內蛋白提取率波動較小，即酸沉時間對蛋白提取率的影響較小，因此在進一步的工藝優化實驗中，不再考慮酸沉時間的影響，綜合考慮后固定為10m in。

圖4 酸沉時間對蛋白質提取率的影響Fig.4 Effect of acid precipitation time on the extraction yield of protein

2.2 堿提酸沉法制備馬鈴薯廢水蛋白工藝條件的優化和最佳因素水平的選擇

三因素二次回歸正交旋轉組合設計結構矩陣與結果如表2所示，其中實驗序號由Design-Expert7.1.3軟件隨機產生。

2.2.1 模型的建立及其顯著性檢驗 利用Design-Expert7.1.3軟件對表2實驗數據進行多元回歸擬合，得到馬鈴薯淀粉廢水蛋白質提取率對堿提pH（A）、堿提時間（B）、酸沉pH（C）的二元多項回歸模型為：

對此模型進行顯著性檢驗，結果見表3，回歸方程系數顯著性結果見表4。

由表3的模型方差分析結果得知，模型的p值為0.0175，達到顯著性差異。失擬項的p值為0.0531，大于0.05不顯著，所以二次模型成立，因此可用此模型分析和預測堿提酸沉提取馬鈴薯淀粉廢水蛋白工藝的優化。

由表4回歸方程系數的顯著性檢驗結果得知，模型的一次項A、B均不顯著，C顯著；二次項A、B顯著，C不顯著；交互項均不顯著；其中酸沉pH的影響因素最大。

表2 響應面實驗設計與結果Table 2 Design of RSM and its experimental values

表3 回歸模型分析結果Table 3 Analysis of variance（ANOVA）for regression equation

表4 回歸方程系數的顯著性檢驗Table 4 Significance testof coefficient in regression equation

剔除不顯著項后的方程模型為：Y=53.33-2.77C-2.62A2-2.51B2

2.2.2 馬鈴薯淀粉廢水蛋白質堿提酸沉提取工藝的響應面分析與優化 根據回歸模型做出相應的響應曲面圖見圖5~圖7。

圖5~圖7直觀的反映了各因素交互作用對蛋白質提取率的影響。堿提pH與堿提時間之間的交互作用、堿提pH和酸沉pH之間的交互作用、堿提時間和酸沉pH之間的交互作用均不顯著。且酸沉pH、堿提pH對馬鈴薯蛋白提取率的影響最為顯著；而堿提時間次之。

圖5 堿提pH與堿提時間交互作用對蛋白質提取的影響Fig.5 Combined effects of alkaliextraction pH and time on the extraction yield of protein

圖6 堿提pH與酸沉pH交互作用對蛋白質提取的影響Fig.6 Combined effects of alkaliextraction pH and acid precipitation pH on the extraction yield of protein

圖7 堿提時間與酸沉pH交互作用對蛋白質提取的影響Fig.7 Combined effects of alkaliextraction time and acid precipitation pH on the extraction yield of protein

2.2.3 提取條件的優化[6-7]通過Design-Expert7.1.3軟件分析，得出堿提酸沉提取馬鈴薯淀粉廢水蛋白的最優工藝為堿提pH 9.35、堿提時間58.67m in、酸沉pH 3.41，酸沉時間10m in，該條件下蛋白質提取率預測值為55.02%。根據上述最優提取工藝，結合實際操作情況，將提取工藝參數修正為堿提pH 9.35、堿提時間59m in、酸沉pH 3.41，酸沉時間10m in，進行驗證實驗，測得的平均蛋白質提取率為54.24%，與預測值相近，證實了該模型的合適性。

2.2.4 酸沉上清液中蛋白超濾提取 酸沉液進一步超濾回收，蛋白質回收率達到了85.62%。結合堿提酸沉工藝總提取率可達93.42%。

超濾的分離機理主要是物理篩分作用，而膜的化學性質對分離特性影響不大[8]。超濾膜具有較高的多孔性，只能阻擋具有低滲透壓的大分子（如蛋白質或膠體）通過。較小的溶質分子與水一起被搬運通過濾膜。因此超濾可在較低的壓力下進行[9]。張澤俊等[10]的研究表明，使用切割分子量1.5萬的醋酸纖維素膜對馬鈴薯廢水進行處理可截留85%的蛋白質；呂建國等[11]研究表明，使用相對切割分子量2萬的PE膜對馬鈴薯廢水進行處理可回收其中約90%的蛋白。但是由于馬鈴薯廢液中含有多種有機物，極易造成膜的嚴重損傷和堵塞，無法長時間連續高效生產。堿提酸沉與超濾相結合不僅總回收率高，而且采用堿提酸沉進行預處理之后，可有效提取大部分馬鈴薯廢水蛋白，大大減輕膜的壓力，對于產業化生產具有積極意義。

3 結論

3.1 通過單因素實驗確定了馬鈴薯淀粉廢水蛋白質提取較適條件為：堿提pH 9~10，堿提時間60m in，酸沉pH3~4.5，酸沉時間10min。

3.2 采用響應面分析法對蛋白質提取工藝進優化，建立了二次多項式回歸方程數學模型：Y=53.33-2.77C-2.62A2-2.51B2。確定了馬鈴薯淀粉廢水預處理的最適工藝條件為：堿提pH 9.35，堿提時間59m in，酸沉pH 3.41，酸沉時間10m in。在此條件下，蛋白質提取率可達54.24%。

3.3 優化后的堿提酸沉工藝結合超濾技術提取馬鈴薯淀粉廢水中的蛋白質，總得率可達93.42%。

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Research of protein extracting from potato starch waster-water

REN Qiong-qiong1，CHEN Li-qing1，HAN Jia-dong1，ZHANG Yu-hao1，2，*，MA Liang1，2
（1.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400716，China；2.Food Engineering and Technology Research Center of Chongqing，Chongqing 400716，China）

The potato p rotein from starch p roducing waste-water was extrac ted by alkali-solution and acidisolation combined w ith ultra-filtration.The extraction p rocessing was op tim ized by sing le factors and response surface analysis.The results showed that the op timum conditions of extrac tion p rocessing of p rotein from potato starch waste-water by alkali-solution and acid-isolation were as follow：the alkali-solution pH9.35，alkali-solution time 59m in，acid-isolation pH3.41，acid-isolation time 10m in.Under these conditions，the extraction rate of p rotein reached 54.24%.While combined w ith ultra-filtration，the extrac tion rate of p rotein reached 93.42%.

potato starch wastewater；alkali-solution and acid-isolation；ultra-filtration；p rotein

TS235.2

B

1002-0306（2012）14-0284-04

2011－11－15 *通訊聯系人

任瓊瓊（1986-），女，碩士研究生，研究方向：糧食、油脂與植物蛋白工程。

石柱農業科技綜合示范基地科技專項基金。