復合發酵蘋果山藥果蔬汁優良乳酸菌菌株的篩選

牛 墨，孟祥晨

（東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030)

復合發酵蘋果山藥果蔬汁優良乳酸菌菌株的篩選

牛 墨，孟祥晨*

（東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030)

以蘋果山藥復合汁為基質，對37株來源于發酵植物制品中的乳酸菌的發酵性能進行初篩和復篩，從中篩選出產酸性能優良的4株菌，分別為：發酵乳桿菌KLDS1.0646、植物乳桿菌KLDS1.0715、瑞士乳桿菌KLDS1.1017和嗜酸乳桿菌LL1。復篩確定發酵乳桿菌KLDS1.0646、瑞士乳桿菌KLDS1.1017和嗜酸乳桿菌LL1為最佳發酵菌種組合，并通過三因子單形重心設計方法確定三種菌種的最佳使用比例為4∶1∶2。

山藥，蘋果，發酵，乳酸菌

果汁、蔬菜汁是新鮮水果和蔬菜用壓榨或其他方法取得的汁液，由于直接榨汁加工的果蔬汁往往因缺少典型果香而影響市場拓展，將乳酸菌應用于果蔬汁進行乳酸發酵，不僅可提供愉快的呈味呈香物質，賦予果蔬汁優雅協調的乳酸發酵風味，而且可產生人體所必需的多種氨基酸、維生素、消化酶等物質，使果汁具有調節人體胃腸道正常菌群、保持微生態平衡，提高鈣、磷、鐵的利用率，促進鐵和VD的吸收，提高食物消化率和機體免疫能力等功效[1-3]。蘋果中富含糖類、酸類、芳香醇類和果膠物質，并富含多種礦物成分，是良好的生理堿性食品[4]。山藥原名薯蕷，是珍貴的藥、菜兩用食物，含有大量的黏蛋白并具有多種益生功能[5]。山藥和蘋果所含營養成分豐富，對人體有益，且彼此的營養成分又互相補充，因此開發研究蘋果山藥乳酸發酵飲料既可使營養更加均衡、全面、易吸收，又可避免因品種單一造成味道欠佳，是較佳的果蔬組合。Kyung[6-7]等人在2005年使用植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和德氏乳桿菌發酵甜菜汁，2006年用植物乳桿菌、干酪乳桿菌和德氏乳桿菌發酵甘藍汁制得具有益生效果的甘藍乳酸菌飲料。2011年，Ana[8]等人利用干酪乳桿菌發酵蘋果汁制得益生菌飲料。王中鳳等[9]也提出，植物乳桿菌、發酵乳桿菌均為優良的果蔬汁乳酸發酵菌。但從產酸量、產酸速度、產品口感、香氣等綜合評價，多菌株混合共發酵最佳。本文主要對適于蘋果山藥復合果蔬汁發酵的乳酸菌進行了篩選，對篩選出來的優良發酵菌株進行組合，優選最佳菌株組合，并通過三因子單形重心設計法[10]確定最佳菌株間的比例，以期為蘋果山藥復合果蔬汁乳酸發酵飲料的研制提供優良菌株和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山藥 市售（無霉爛變質);蘋果 市售國光蘋果（成熟，無腐爛);糖化酶 湖南省津市市新型發酵有限責任公司，酶活50000U/g;果膠酶 肇東市日成酶制有限公司，酶活30000U/g;檸檬酸、白砂糖 均為食品級;供試菌株 乳品科學教育部重點實驗室工業微生物菌種保藏中心（KLDS-DICC)保存37株乳酸菌;乳桿菌的培養采用MRS培養基[11];擴培種子培養基[12]：復合果蔬汁（蘋果汁∶山藥汁=1∶1)+0.5%蛋白胨+0.5%牛肉膏。

九陽多功能榨汁機;DELTA-320 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海)有限公司;電熱恒溫培養箱DHP-9272 上海一恒科技有限公司;電熱恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司;WY032T手持糖度計

成都萬辰光學儀器;GYB-6S均質機 上海華東高壓均漿機廠;萬用電爐 北京市永光明醫療儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘋果和山藥汁制備的工藝流程 山藥汁的制備[13]：山藥去皮、切片→0.2%檸檬酸水護色（90～95℃，5min)→加入3倍水置于搗碎機粉碎打漿→糊化（90～95℃，30min)→加入糖化酶糖化（55～60℃，3h)→滅酶（85℃，3min)→紗布過濾→均質機均質（20～25MPa，65～75℃)→山藥汁

蘋果汁的制備[14]：蘋果去皮、切片→0.2%檸檬酸水護色（90～95℃，5min)→加入3倍水置于搗碎機粉碎打漿→加入果膠酶（40～50℃，3h)→滅酶（85℃，3min)→紗布過濾→均質機均質（20～25MPa，65～75℃)→蘋果汁

復合果蔬汁發酵基質的制備：將均質后的山藥汁、蘋果汁用Na2CO3調pH到6.5左右，將山藥汁和蘋果汁按1∶1混勻，于90～95℃滅菌10min后作為發酵基質備用。

1.2.2 菌株的活化及擴培 乳桿菌在MRS培養基中于37℃條件下培養20h左右進行活化，活化2～3代后的菌株以6%的接種量接種于擴培種子培養基中擴培。

1.2.3 單菌株的初篩 將各供試菌株經活化、擴培后，分別以6%接種量接種于添加3%蔗糖的復合果蔬汁發酵基質中，37℃發酵24h，在此期間每隔4h測一次滴定酸度和pH，選擇滴定酸度高、pH低的菌株進行復篩。

1.2.4 優良單一菌株的復篩 將初篩獲得的菌株經活化、擴培后，分別以6%接種量接種于添加3%蔗糖的復合果蔬汁發酵基質中，在37℃發酵16h，測定其滴定酸度和活菌數，計算產酸速率，選擇產酸速率快、活菌數高的菌株再確定最佳菌株組合。

1.2.5 最佳菌株組合的確定 將篩選出來的菌株經活化、擴培后，不同菌株間以相同比例按6%接種量接種于添加3%蔗糖的復合果蔬汁發酵基質中，在37℃發酵14h，在此期間每隔2h測一次滴定酸度和pH。

1.2.6 發酵菌株間最佳比例的確定 采用混料設計中的三因子單形重心設計[11]優化三種發酵菌種的使用比例，使用實驗設計軟件Design Expert 7.0.0，用y表示實驗指標，A、B、C分別表示篩選出的最佳組合的3株菌（發酵乳桿菌KLDS1.0646、瑞士乳桿菌KLDS1.1017、嗜酸乳桿菌LL1)在混合發酵劑中各占的百分比，確定發酵菌株間最佳比例，根據實驗設計按菌種間不同比例接種于復合果蔬汁發酵基質中，于37℃條件發酵14h后，分別測定滴定酸度。

1.2.7 分析方法 可溶性固形物：按GB/T 12143- 2008;pH：按GB/T12456- 2008;總糖、還原糖的測定：GB/T 5009.7- 2008;酸度：采用酸堿滴定法[15]。菌落總數：參照GB/T4789.35-2010進行計數。

2 結果與討論

2.1 鮮榨果蔬汁主要理化指標的測定

根據1.2.7的分析方法測定鮮榨蘋果汁、山藥汁主要的理化指標，結果見表1。

表1 鮮榨果蔬汁的理化指標Table 1 The physical and chemical indexes of vegetable and fruit juice

2.2 優良發酵菌株的初篩

復合果蔬汁發酵基質經37株乳桿菌分別發酵后，所獲得的pH及滴定酸度見表2和表3。

由表2、表3可知，由于蘋果山藥復合汁中含有一定量的糖類、蛋白質等營養物質，所有菌株隨發酵時間延長，發酵液pH均呈下降趨勢，酸度相對呈上升趨勢，產酸量不斷增加。且在發酵12h時發酵液pH大多降至4.2以下，12h之后pH變化幅度較小，基本趨于穩定;在發酵16h之后滴定酸度的變化幅度較小，基本趨于穩定，說明在12～16h之間可能產生了大量的有機酸，所以初步確定發酵時間為16h。

表2 不同菌株發酵蘋果山藥汁的pH變化Table 2 Changes of pH in apple and yam juice fermentation by different strains

續表

表3 不同菌株發酵蘋果山藥汁的滴定酸度的變化（°T)Table 3 Changes of the titration acidity in apple and yam juice fermentation by different strains（°T)

續表

表4 初篩獲得菌株在復合果蔬汁基質中發酵的產酸速率及活菌數Table 4 The acid production rate and LAB activity of the apple and yam juice fermentation by the initial screening strain

如表3所示，各菌株在發酵過程中，KLDS1.0646、L33、KLDS1.0715、KLDS1.0719、LL1、KLDS1.9207、KLDS1.0732、KLDS1.0738、L4、KLDS1.1017等10個菌株在發酵16h時的產酸量較大，選擇這些菌株對其進行復篩。

2.3 優良發酵菌株的復篩

將添加3%蔗糖的復合果蔬汁發酵基質分別接種10株初篩菌株進行發酵，測定其活菌數及滴定酸度，并計算產酸速率，結果見表4。

如表4可知，發酵性能最好的發酵乳桿菌為KLDS1. 0646;發酵性能最好的植物乳桿菌為KLDS1. 0715;發酵性能最好的瑞士乳桿菌為KLDS1. 1017;發酵性能最好的嗜酸乳桿菌為LL1。對復篩獲得的株菌進行配對組合，進一步確定發酵菌種。本實驗結果表明，適合蘋果山藥復合汁乳酸發酵的優良菌株分別為發酵乳桿菌KLDS1.0646、植物乳桿菌KLDS1.0715、瑞士乳桿菌KLDS1.1017和嗜酸乳桿菌LL1。菌株選擇是乳酸發酵的關鍵之一，一般按下列條件進行：具有生香性，無異味;產酸量高;對果蔬發酵適應性強。植物乳桿菌、發酵乳桿菌、嗜酸乳桿菌等均為優良的蔬菜乳酸發酵菌[9]。

2.4 最佳菌株組合的確定

菌種在很大程度上決定了產品最終的口感風味和其他特性。因此，使用多菌種混合發酵生產乳酸發酵飲料，具有更廣闊的發展前景[16]。王中鳳等[9]也提出植物乳桿菌、發酵乳桿菌均為優良的果蔬汁乳酸發酵菌，從產酸量、產酸速度、產品口感、香氣等方面綜合評價，多菌株混合發酵最好。

對復篩獲得的4株發酵菌株分別按下列方式組合：KLDS1.0646+KLDS1.1017+KLDS1. 0715;KLDS1.0646+ KLDS1.1017+LL 1;KLDS1.0646+KLDS1.0715+LL 1;KLDS1.0646+KLDS1.1017+KLDS1.0715+LL1。每種組合分別按6%接種量（各組合中的菌株等比例)接種于添加3%蔗糖的復合果蔬汁發酵基質中37℃發酵16h，每隔2h分別測定滴定酸度及pH，結果見圖1。

圖1 復合菌株37℃發酵蘋果山藥汁過程中滴定酸度（—)和pH（ )的變化曲線Fig.1 The change curve of the titration Acidity（—)and pH（ )in apple and yam juice during the processof fermentation on 37℃by compound strains

由圖1可知，菌株組合KLDS1.0646+KLDS1.1017+ LL1的產酸速度最快，最終的滴定酸度也比其他三組高。并且該組合的最終產酸量比三株單獨發酵菌株的都高，說明三株菌共同發酵時有一定的共生作用。由于利用不同乳酸菌的生理生化特點，如對糖、蛋白質、氧氣等的利用能力的不同，混合菌株發酵時可以互為對方提供適宜的生長環境，并達到代謝產物的互補。在乳酸菌發酵過程中，使用混合菌種發酵明顯地優于單菌發酵。研究表明，混合菌種要比單菌種發酵要好。并確定KLDS1.0646+KLDS1.1017+LL1為最佳發酵菌株。發酵乳桿菌KLDS1.0646、瑞士乳桿菌KLDS1.1017、嗜酸乳桿菌LL1三株菌共同發酵比任何單一菌株發酵產酸量都高。由于本研究所選擇使用的發酵乳桿菌KLDS1.0646可顯著改善小鼠的β-Lg過敏癥狀[17]，所以確定的最佳發酵菌株具有一定的生理功效。

此外，圖1還表明，上述組合的發酵菌種在14h時產酸達到最大量，因此下面的實驗確定發酵時間為14h。

2.5 復合發酵劑配比的優化

采用三因子單形重心設計方法確定三個發酵菌株間最佳比例，根據單形重心實驗方法的設計進行實驗并測定結果，計算實驗設計中三個因子的單形坐標與滴定酸度之間的關系，結果見表5、表6。

表5 實驗設計與結果Table 5 The design and result of experiments

表6 回歸模型方差分析Table 6 Analysis of mean square deviation for regression model

根據實驗結果計算的滴定酸度的響應方程如下：

y=79.44A+58.94B+66.16C+17.85AB+38.79AC+ 5.99BC+104.43ABC （1)

由方差分析結果（表6)可知，所得模型極顯著（p＜0.01)，失擬項p=0.2323＞0.05，失擬不顯著，說明該回歸模型是顯著的。回歸方程與實際實驗擬合較好，實驗誤差較小，說明響應方程（1)模型建立成功。

為了檢驗響應方程的顯著性，對表7中實驗的估計值和實測值之間進行t檢驗。經過t檢驗，證明在置信度α=0.05，估計值和實測值之間無顯著差異，即估計值滿足實測值，回歸方程（1)在置信度α=0.05預測顯著。

表7 驗證實驗設計與結果Table 7 The design and result of verification experiments

根據回歸方程（1)可知，KLDS1.0646對滴定酸度的影響最大，而且LL1對滴定酸度的影響比KLDS1.1017大。因為KLDS1.0646和LL1之間交互作用較大，說明它們具有協同的共生作用。對響應方程進行線性規劃求解，得y的最大值為83.7921，相應的編碼值為A= 0.579，B=0.127，C=0.294。根據編碼值，由公式（1)計算可得實際各菌株的比例，即三種發酵菌株的最佳比例為：KLDS1.0646∶KLDS1.1017∶LL1=4∶1∶2。

作為混合菌種，混菌比例對發酵速度有一定的影響，本實驗運用三因子單形重心設計法，通過較少的實驗全面了解三者之間的比例變化對滴定酸度的影響，并確定三種菌種的最佳使用比例為4∶1∶2。

3 結論

從37株來源于發酵植物制品中的乳酸菌中篩選出4株能較好發酵蘋果山藥復合汁的菌種，分別為：發酵乳桿菌KLDS1.0646、植物乳桿菌KLDS1.0715、瑞士乳桿菌KLDS1.1017和嗜酸乳桿菌LL1。并確定發酵乳桿菌KLDS1.0646、瑞士乳桿菌KLDS1.1017、嗜酸乳桿菌LL1三株菌共同發酵比任何單一菌株發酵產酸量都高，表現出一定的共生發酵特性。運用三因子單形重心設計法確定三種菌種的最佳使用比例為4∶1∶2，以6%接種量接種于含3%蔗糖的蘋果山藥復合發酵基質中，于37℃發酵14h后可獲得較好的發酵產品，以期為蘋果山藥復合果蔬汁乳酸發酵飲料的研制提供優良菌株和理論依據。

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Screening of excellent LAB strains suitable for multi fermentation of the mixed apple and yam juice

Niu Mo，Meng Xiang-chen*
（Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

In this experiment，the mixed juice with apple and yam was used as substrate，and the fermentation characteristics of 37 lactic acid bacteria strains isolated from fermented vegetable products were studied.Four strains including Lactobacillus fermentum KLDS1.0646，Lactobacillus plantarum KLDS1.0715，Lactobacillus helveticus KLDS1.1017 and Lactobacillus acidophilus LL1 with excellent ability of acid production were selected. The optimum combination were Lactobacillus fermentum KLDS1.0646，Lactobacillus helveticus KLDS 1.1017 and Lactobacillus acidophilus LL1，and the optimal proportion of strains was KLDS1.0646∶KLDS1.1017∶LL1=4∶1∶2，which was determined by simplex centroid design.

yam;apple;fermentation;lactic acid bacteria

TS255.44

A

1002-0306（2012)14-0242-06

2012－02－13 *通訊聯系人

牛墨（1987-)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學。