窄分子量分布殼聚糖的制備工藝研究

李星科，縱 偉，夏文水

（1.鄭州輕工業學院食品與生物工程系，河南鄭州 450002;2.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122)

窄分子量分布殼聚糖的制備工藝研究

李星科1，縱 偉1，夏文水2，*

（1.鄭州輕工業學院食品與生物工程系，河南鄭州 450002;2.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122)

研究了超聲波法制備窄分子量分布殼聚糖的制備工藝，在單因素實驗的基礎上，根據旋轉組合設計原理，研究溫度、殼聚糖濃度、乙酸濃度三個影響因素對超聲波處理后殼聚糖分子量分布指數的影響，并建立了回歸數學模型，通過實驗結果進行方差分析及對數學模型進行優化得到了窄分子量分布的殼聚糖的制備條件。結果表明，最佳工藝參數為：溫度24℃、乙酸濃度0.27mol/L，殼聚糖濃度根據實際需要定為1%，經過超聲波處理后殼聚糖分子量分布指數從11.51降到了4.25。

殼聚糖，超聲波處理，分子量分布指數，優化

分子量分布是指高聚物中各種不同的分子量組分在總量中所占的分量，一般用分子量分布指數表示，重均分子量與數均分子量的比值（Mw/Mn)，比值愈大說明分子量分布愈寬。分子量分布直接影響著高聚物的物理化學性質以及其加工性能等[1]。殼聚糖是自然界唯一的堿性多糖，具有生物相容性、可降解性、無毒性及多種對人體有益的功能活性，日益受到人們的關注和青睞，在食品、化工、紡織、醫藥、環保等領域都有著廣泛的用途[2]。殼聚糖屬于高聚物，自然界中天然存在的殼聚糖分子量一般也在幾萬至上百萬不等，經過化學方法提取出來的殼聚糖的分子量一般分布很寬[3]。Mette H Ottsy等用凝膠過濾色譜法對殼聚糖進行分級[4]，這種方法得到的多糖純度較高，但該技術過程較為繁瑣、處理量太小難以實現工業化應用。非對稱場流分離技術（AFFFF)是一個全新的技術，能快速而有效分離和準確表征不同的粒子和高聚物，Mao Shirui和Augsten Christian利用非對稱場流分離技術對殼聚糖進行了分離，但是該技術也存在處理量太小的問題，適合于分離和測定大分子化合物、膠體和顆粒樣品[5-6]。據報道超聲波處理可以降低殼聚糖的分子量分布指數，而且處理過程中殼聚糖的氨基含量不會發生改變[7-10]。因此本文采用超聲波處理殼聚糖，并系統研究關鍵因素對超聲波處理后殼聚糖分子量分布指數的影響，以確定超聲波法制備窄分子量分布殼聚糖的最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

殼聚糖（重均分子量58萬，分子量分布指數11.52，脫乙酰度86.1%，實驗室自測) 由南通雙林生物制品有限責任公司提供;冰乙酸、氨水等 均為分析純。

Y88-II超聲波細胞破碎儀 中國寧波新芝生物科技股份有限公司;CHRIST凍干機 德國Martin Christ GmbH;DELTA-320-S pH計 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;Waters600高效液相色譜儀 包括2410示差折光檢測器、Empower工作站、ultrahydrogel 2000和ultrahydrogel 250色譜分離柱。

1.2 實驗方法

1.2.1 超聲波處理殼聚糖 將一定量的殼聚糖溶解于酸溶液中配制成殼聚糖溶液，冰箱中放置過夜，于一定溫度下間歇式超聲波處理后，用稀氨水溶液調節溶液的pH至8～8.5，收集沉淀，用蒸餾水反復洗滌至中性，冷凍干燥即得到樣品。

1.2.2 單因素實驗設計 當超聲波細胞破碎儀的功率為150W，超聲時間為60min時，研究殼聚糖濃度（0.5%、1.0%、1.5%、2%)、酸的種類（相同濃度的乙酸、鹽酸、乳酸溶液)、乙酸濃度（0.1、0.2、0.5、1mol/L)、溫度（10、30、50℃)、溶液pH（3.9、4.4、4.9、5.4、5.9)等因素對超聲波處理后殼聚糖分子量分布指數的影響。

當超聲波細胞破碎儀的功率為150W、殼聚糖濃度為1.0%、乙酸濃度為0.2mol/L、溫度為30℃時，研究不同的超聲時間對殼聚糖分子量分布指數的影響。

1.2.3 旋轉正交實驗設計 在單因素實驗的基礎上，采用三因素二次通用旋轉實驗設計，研究溫度、殼聚糖的濃度、乙酸濃度3個因素對超聲波處理后的殼聚糖分子量分布指數的影響。其中超聲波細胞破碎儀的功率為150W，超聲時間為60min。因素水平編碼如表1所示。

表1 三因素二次通用旋轉設計因素水平編碼表Table 1 Factors and levels coding of three factors quadratic rotation design

1.2.4 殼聚糖分子量分布的測定 在Waters600高效液相色譜儀（2410示差折光檢測器、Empower工作站)上，用ultrahydrogel 2000和ultrahydrogel 250作為色譜分離柱，進行分子量分布測定，用Empower工作站進行數據采集和分析，標準樣品為已知分子量的水溶性右旋糖苷（2000000、133800、41100、21400、4600、2500)，以0.2mol/L CH3COOH/0.15mol/L CH3COONH4緩沖溶液為流動相，流速為0.9mL/min，柱溫30℃。

分子量分布指數=重均分子量（Mw)/數均分子量（Mn)

1.2.5 殼聚糖脫乙酰度（DD)的測定 DD的測定參見文獻[10]。

1.2.6 數據分析與作圖 采用SASV8軟件進行統計分析，orign8.0軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 殼聚糖濃度的影響 當超聲波細胞破碎儀的功率為150W、乙酸濃度為0.2mol/L、溫度為30℃、超聲時間為30min時，研究不同的殼聚糖濃度對超聲處理后的殼聚糖分子量分布指數的影響。如圖1所示，在殼聚糖濃度0.5%～2.0%的范圍內，隨著殼聚糖濃度的增大，殼聚糖的分子量分布指數增大，說明殼聚糖濃度對超聲波處理后殼聚糖的分子量分布有一定的影響。

圖1殼聚糖濃度對分子量分布的影響Fig.1 Effect of chitosan concentration on molecular weight distribution

2.1.2 酸的種類的影響 將殼聚糖分別溶解在相同濃度的乳酸、乙酸和鹽酸溶液，當超聲波細胞破碎儀的功率為150W、殼聚糖濃度為1%、酸濃度為0.2mol/L、溫度為30℃、超聲時間為30min時，研究酸的種類對超聲波處理后的殼聚糖分子量分布的影響。如圖2所示，經超聲波處理的殼聚糖的分子量分布指數三者沒有顯著差別，說明酸的種類對超聲波處理后殼聚糖的分子量分布沒有顯著影響。

圖2 酸種類對分子量分布的影響Fig.2 Effect of acid species on molecular weight distribution

2.1.3 乙酸濃度的影響 當超聲波細胞破碎儀的功率為150W、殼聚糖濃度為1%、溫度為30℃、超聲時間為30min時，研究乙酸濃度對超聲波處理的殼聚糖的分子量分布指數的影響。如圖3所示，在0.1～1mol/L的范圍內，隨著乙酸濃度的提高，超聲波處理的殼聚糖的分子量分布指數先減小后增大，在濃度0.2mol/L時達到最低，但濃度大于0.5mol/L時，乙酸濃度對處理后的分子量分布指數影響不大，說明乙酸濃度對超聲波處理后殼聚糖的分子量分布有一定的影響。

圖3 乙酸濃度對分子量分布的影響Fig.3 Effect of acetic acid concentration on molecular weight distribution

2.1.4 超聲時間的影響 當超聲波細胞破碎儀的功率為150W、殼聚糖濃度為1%、乙酸濃度為0.2mol/L、溫度為30℃時，研究超聲時間對超聲波處理的殼聚糖的分子量分布指數的影響。如圖4所示，在0～90min內，隨著時間的延長，超聲波處理后的殼聚糖的分子量分布指數呈下降趨勢，在0～60min內下降比較快，在60～ 90min內下降比較緩慢，說明處理時間對分子量分布指數有顯著影響。

圖4 超聲時間對分子量分布的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on molecular weight distribution

2.1.5 溫度的影響 當超聲波細胞破碎儀的功率為150W、殼聚糖濃度為1%、酸濃度為0.2mol/L、超聲時間為30min時，研究溫度對超聲波處理的殼聚糖的分子量分布指數的影響。如圖5所示，在選擇的10、30、50℃三個溫度范圍內，隨著溫度的升高，超聲波處理后的殼聚糖的分子量分布指數先減小后增大，在30℃條件下處理殼聚糖得到的分子量分布最窄，說明溫度對超聲波處理后殼聚糖的分子量分布有一定的影響。

圖5 溫度對分子量分布的影響Fig.5 Effect of temperature on molecular weight distribution

2.1.6 pH的影響 當超聲波細胞破碎儀的功率為150W、殼聚糖濃度為1%、酸濃度為0.2mol/L、溫度為30℃、超聲時間為30min時，研究溶液的pH對超聲波處理后殼聚糖的分子量分布指數的影響。如圖6所示，在3.9～5.9的范圍內，隨著殼聚糖溶液pH的升高，超聲波處理后的殼聚糖的分子量分布指數先增大后減小，在pH4.4時達到最大值。而在pH4.4、4.9、5.4、5.9的條件下，超聲波處理后的殼聚糖的分子量分布指數都比殼聚糖溶解于單一的乙酸溶液后的pH3.9都大，說明pH對超聲波處理后殼聚糖的分子量分布沒有積極的影響。

圖6 pH對分子量分布的影響Fig.6 Effect of pH on molecular weight distribution

從單因素實驗可以得出，殼聚糖濃度、乙酸濃度和溫度對超聲波降解后的殼聚糖的分子量分布指數影響較大，因此選擇這三個因素建立旋轉組合設計，系統研究關鍵因素對超聲波處理后殼聚糖分子量分布指數的影響，并確定超聲波法制備窄分子量分布殼聚糖的最佳工藝。

2.2 三因素二次通用旋轉實驗的結果分析

表2 三因素二次通用旋轉設計及結果Table 2 Three elements quadratic current revolving design and results

表3 實驗結果的方差分析Table 3 Variance analysis of experimental results

2.2.1 回歸分析及回歸模型的建立 對實驗所得的結果采用SAS軟件RSREG過程進行多元回歸分析，表3為實驗結果的方差分析表。由表3可知，該回歸模型的F值為165，大于在0.01水平上的F值，而失擬項的F值為4.41，小于在0.05水平上的F值，說明模型擬合結果較好;此外由表3可知，回歸方程的一次項均差異極顯著（p＜0.0001)，說明各個單因素都對分子量分布值有極顯著影響;二次項中X1、X3對分子量分布值有極顯著影響，而X2對分子量分布值有顯著影響，說明三因素對分子量分布值的影響并不是簡單的線性關系，但是因素之間的交互作用對分子量分布值的影響不顯著[11-12]。

以分子量分布指數為Y值，得出與三種實驗因素的編碼值為自變量的回歸方程。一次回歸模型和二次回歸模型的F值都可以說明模型方程差異極顯著;回歸方程的決定系數R2=0.9933，失擬項分析表明，該回歸方程無失擬因素存在，回歸模型與實測值能較好地擬合，因此可以用該模型分析各工藝參數對分子量分布指數的影響。由該回歸方程偏回歸系數絕對值的大小，可以得到各因素影響程度從大到小依次排列為殼聚糖的濃度、溫度和乙酸濃度。

2.2.2 單因素效應分析 在單因子效應分析中，采用降維分析，將其它的因素固定在零水平，可分別得到各個單因素對應的回歸方程，從此可以表述單因素變動時對分子量分布指數的影響，3個單因子效應方程如下，根據以上式（1)作圖，可以得到單因子效應曲線圖7。

目前研究認為，超聲波處理大分子物質的主要機理是機械性斷鍵作用以及自由基的氧化還原反應，部分學者認為機械效應所作用的位點靠近最大分子的中心[13-16]。因此經過超聲波處理后，大分子的殼聚糖變成小分子的殼聚糖，殼聚糖的平均分子量降低，而小分子的殼聚糖變化不大，分子量分布指數也減小。李瑾等研究證明隨反應時間的延長，分子量大的殼聚糖更容易受到降解，其降解速率和降解速率常數降低較快，而分子量小的殼聚糖具有較低的降解速率和降解速率常數，隨時間變化不明顯[17]。

2.2.2.1 溫度的效應分析 隨著溫度的升高，殼聚糖的分子量分布指數先減小后增大，這與單因素實驗結果相一致。當溫度的實驗水平為-0.2680時，即溫度為26.8℃時，分子量分布指數最小。當溫度開始升高時，殼聚糖分子熱運動加劇，快速變化的機械運動足以引起大分子的殼聚糖分子中共價鍵的斷裂，而導致殼聚糖的降解，分子量分布指數的降低;同時溫度升高，溶劑蒸氣壓隨著增大，樣品溶液內部的氣體流失，超聲空化作用產生的空泡爆裂強度較低，所釋放出的能量也就較低，產生的自由基也少，因此由自由基氧化還原反應引起的殼聚糖的降解速率降低，分子量分布指數升高。從圖7可以看出，在溫度低于26.8℃時，分子量分布指數隨溫度的升高而降低趨勢并不明顯，而當溫度高于26.8℃時，超聲降解作用隨著溫度的升高而升高的趨勢非常顯著。這也說明了，殼聚糖的降解是機械效應與自由基的氧化還原反應的共同作用的結果。

圖7 單因子效應曲線Fig.7 Single factor utility curves

2.2.2.2 殼聚糖濃度的效應分析 濃度對分子量分布指數的影響接近線性關系，從圖7可以看出，分子量分布指數隨著體系中殼聚糖濃度的增大而增大。這與Chen Rong Huei等的研究結果一致[7]。殼聚糖溶液濃度較大時，在相同的超聲功率下，分子鏈所接受的切點少，分子量變化幅度小，而濃度低時分子鏈所接受的切點多，分子量下降幅度大，殼聚糖降解速度快。同時殼聚糖濃度低時，溶液粘度也低，有利于空化泡的發生，從而使降解反應容易進行。

2.2.2.3 乙酸濃度的效應分析 乙酸濃度分子量分布指數的影響是二次關系，從圖7可以看出，隨著乙酸濃度的增加，殼聚糖的分子量分布指數是先減小后增大，這與單因素實驗結果相一致。當乙酸濃度的實驗水平為-0.3341時，即乙酸濃度為0.26mol/L時，分子量分布指數最小。Trzcinski等用低功率超聲發生器降解殼聚糖時發現，動力學降解速率參數k隨著乙酸濃度的增加而增加，表明超聲能夠加速殼聚糖酸性水解[15]。因為酸性水解是無規律的，因此這也說明了隨著乙酸濃度的增加，分子量分布指數升高的原因。

將各模型分別固定2個因素于0水平，可以得到剩下1個因素與分子量分布指數的一元降維的回歸模型，得到單因子邊際效應方程。單因子邊際效應方程反映了分子量分布指數隨不同因子編碼值的變化速率。單因子效應方程如下：

圖8 邊際效應曲線Fig.8 Marginal utility curves

根據單因子邊際效應方程可以作出單因子邊際效應曲線。由圖8可知，隨著因素水平的提高，X1、X2、X3的邊際得率都呈上升趨勢。3條單因子邊際效應曲線中，超聲溫度對應的斜率最大，其次是乙酸濃度，最小的是殼聚糖濃度對應的斜率，這說明殼聚糖濃度的變化對分子量分布的邊際得率的影響較其他兩個因素穩定。當X1、X3的水平分別取-0.2680、-0.3341時，X1、X3的邊際得率均為0，此時無減小效應，2個因素在該水平對應的分子量分布指數達到最小值，繼續提高因素水平，邊際得率為正值，分子量分布指數開始增大。

2.3 最佳工藝參數的確定及回歸模型的驗證

表4 回歸模型驗證和結果比較Table 4 Validation of regression model and result comparison

由SAS軟件RSREG過程結果可知，當溫度、乙酸濃度分別為24℃、0.27mol/L（相當于1.6%)時，殼聚糖濃度是越小越好，此時能取得分子量分布指數的最小值。殼聚糖濃度很低，每次的處理量太小，在實際操作中選擇殼聚糖濃度為1%左右較適宜。理論值與實際值經驗證誤差為1.7%，所以該模型較好地反映了各因素對分子量分布指數的影響。如圖9所示，經過超聲波處理后殼聚糖分子量分布變窄了，分子量分布指數從11.51降到了4.25。

超聲波處理后的殼聚糖的脫乙酰度基本沒有改變，這與王偉、Baxter等人的研究結果一致[9，14]，這表明超聲波作用于殼聚糖時，對殼聚糖分子內存在的四種不同的糖苷鍵連接方式不存在特異性識別能力，所以不會選擇性地切斷殼聚糖分子的糖苷鍵，使得降解產物的脫乙酰度與殼聚糖原料相比沒有改變。

圖9 殼聚糖的分子量分布Fig.9 Molecular weight distribution of chitosan

3 結論

對超聲波處理后殼聚糖分子量分布指數的影響因素由大到小依次順序是殼聚糖濃度、溫度、乙酸濃度。采用三因素二次通用旋轉設計，建立了溫度、殼聚糖濃度和乙酸濃度3個因素對應的分子量分布指數的數學模型，實現了對工藝的優化，得出最佳工藝參數：溫度為24℃、乙酸濃度為0.27mol/L、殼聚糖濃度根據實際需要定為1%，各個因素對分子量分布指數的影響由大到小依次順序是殼聚糖濃度、溫度、乙酸濃度。經過化學方法提取出來的殼聚糖一般分子量分布很寬，但是經過超聲波處理后分子量分布變窄了，分子量分布系數從11.51降到了4.25。

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Study on preparing technique of chitosan with narrow molecular weight distribution

LI Xing-ke1，ZONG Wei1，XIA Wen-shui2，*
（1.Department of Food&Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，China;2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

Preparing technique of chitosan with narrow molecular weight distribution through ultrasonic processed was investigated.According to the rotary unitized design principles，the influence of temperature and the concentration of chitosan and acetic acid on the polydispersity of chitosan after ultrasonic process were studied and the mathematical model was established based on the basis of single factor experiments.The preparation conditions of chitosan with narrow polydispersity were obtained by variance analysis and the optimization of mathematical model.Results showed that the optimum conditions of ultrasonic process were that the temperature of 24℃，the concentration of acetic acid of 0.27mol/L and the concentration of chitosan of 1%according to the actual situation.The polydispersity of chitosan decreased from 11.51 to 4.25 after ultrasonic processed.

chitosan;ultrasonic process;polydispersity;optimization

TS201.1

B

1002-0306（2012)14-0255-05

2011－11－29 *通訊聯系人

李星科（1981-)，男，講師，博士，研究方向：多糖化學。

國家863計劃項目（2007AA100401);重點實驗室目標導向項目（SKLF-MB-200805);江蘇省科技成果轉化項目（BA2009082)。