用蛋白質組學方法分析先兆子癇孕婦血清差異蛋白表達和急性反應蛋白

劉崇東 魯 琦 張震宇* 鄧海騰

(1.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院婦產科，北京 100020;2.清華大學生命科學院，北京 100083)

先兆子癇是孕婦妊娠期特有的疾患，它的特點是孕20周后出現高血壓及妊娠蛋白尿。在發展中國家其發病率高達9.4% ～10.4%，是導致孕產婦和新生兒死亡的首要原因［1］。子癇和先兆子癇的診治水平與孕產婦病死率關系密切，而孕產婦病死率是評價國家衛生保健事業水平的重要指標。目前還沒有一種很好的實驗指標可以對先兆子癇進行早期診斷。Roberts J M等［2］的研究表明，先兆子癇是一個多系統綜合征，有復雜的病理生理改變，例如:血管內皮損傷、炎性反應、凝血系統的激活和代謝的改變。目前普遍認為先兆子癇的病理生理改變是由于一些蛋白的異常表達。這些蛋白的確認對我們闡述先兆子癇的病理生理機制的分子基礎有很大幫助，也可以作為先兆子癇早期診斷的生物指標。

使用蛋白質組學方法對先兆子癇患者血清的研究蛋白質進行確認，Gong L Y等［3］用SELDI-TOF-MS的方法研究，發現在妊娠高血壓疾病患者與正常妊娠婦女，血清中有10個異常蛋白表達峰。Blumenstein M等［4］應用免疫沉淀技術和2D膠聯合，在先兆子癇患者中發現了39個差異表達蛋白，這些蛋白與脂代謝、凝血、血管重塑、蛋白酶抑制活性和炎性反應有關。在本研究中，我們應用親水親脂柱(hydrophiliclipophilic balance，HLB)和多肽配體庫磁珠(peptide ligand library bead，PLLB)的方法，去除血清中高表達蛋白使低含量蛋白表達豐富，對重度先兆子癇患者和正常妊娠婦女血清中的差異蛋白和一些炎性蛋白表達進行分析。

1 材料和方法

1.1 樣本的收集

血清的樣本均來自于2008年1～12月首都醫科大學附屬北京朝陽醫院婦產科收治的孕晚期重度先兆子癇前期患者和正常孕足月產婦各5例，收集樣本。先兆子癇的診斷根據國際高血壓教育協作組對妊娠高血壓的診斷標準。妊娠20周以后出現臨床癥狀，伴有輕度頭暈、頭痛等;收縮壓≥160 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，舒張壓≥110 mmHg，連續 2次血壓增高，每次至少間隔6 h;尿蛋白≥++，24 h蛋白尿≥5g/24 h;既往無高血壓及腎臟病史;既往無先兆子癇病史。取樣之前詳細向患者交代取樣方法、風險及樣本的用途。患者充分知情并簽署知情同意書。知情同意書已被首都醫科大學附屬北京朝陽醫院倫理委員會審核通過。外周血獲得的樣本，靜放2 h，4 000 r/min 4℃快速離心10 min。然后儲存在－80℃冰箱等待分析使用。

1.2 樣本準備

5份正常妊娠婦女的血清，5份重度先兆子癇患者血清分別混合在一起，等量血清120 mL，等量混合后共600 mL。600 mL血液分別用HLB和PLLB方法進行樣本處理。

1.3 HLB血清處理

血清樣本分別稀釋到1 mL;1 mL純水+1 mL甲醇平衡HLB柱(均購自Thermo公司);2個分離柱分別加入正常孕婦血清和重度子癇孕婦血清，1%TFA(三氟乙酸，購自美國Abcam公司)清洗2遍;收集洗脫液。

1.4 PLLB血清處理

8 mg PLLB 磁珠 (Peptide International，Lexington，NY)放入100 μL 50% 甲醇10 min，pH7.4 PBS清洗3遍;2份血清和PLLB分別在室溫(22～25℃)搖擺器上培養2 h;去除未結合物質，再次用pH7.4 PBS清洗3遍;與LDS 100℃ 共培養5 min，洗脫蛋白。

1.5 蛋白的分離、膠內消化和LC/MS/MS分析

蛋白用4% ～12%Tris-Glycin梯度SDS膠 (Invitrogen，Grand Island，NY)進行分離;用考馬斯亮藍進行染色(Invitrogen，Grand Island，NY);每條帶切割15個小片段，切割后片段分別根據流程進行膠內消化。每份消化產物分別進行LC-MS/MS分析。首先用Dionex 300 nano-HPLC系統進行60 min的洗脫，流速為0.25 μL/min(購自 Thermo公司)，用 LTQ-Orbitrap質譜使用Xcalibur 2.0.7軟件進行操作，Orbitrap(400－1800 m/z，30，000 Resolution)單一氣相圖譜，連接6個數據獨立的MS/MS掃描。

1.6 數據處理和定量分析

每個從LC/MS/MS獲得的MS/MS圖譜都需從原始數據形式轉化為DTA文件(Bioworker 3.3.1，Thermo-Fisher，Sanlose，CA)使用Mascot針對人類IPI database搜索DTA文件;Mascot評分＞30，蛋白才被確認，并且至少有2個獨立的肽段與之相匹配;應用Perl script spectral counts對每個確認的蛋白進行定量分析;2組質譜數比值大于2或小于0.5，認定為有差異。

1.7 Western blotting分析

2例孕晚期重度先兆子癇患者60 μg蛋白和2例正常孕足月婦女60 μg血清蛋白分別用 NuPAGE Novx 40 12%Bis Tris梯度膠進行分離 (Invitrogen，NY);轉膜30 min;4℃封閉過夜;室溫加入一抗孵育120 min;特異性抗體 RBP4和銅藍蛋白(ceruloplasmin，CP)(Abcam，Cambriage，MA);用 TBST(0.1%Tween 20，0.01 mol/L TBS)清洗;轉膜分別用與二抗(抗鼠)caruloplasmin進行孵育，用ECL顯色劑曝光(Thermo，waltham，MA)。

1.8 統計學方法

所有數據使用統計學軟件SPSS13.0進行統計分析處理，數值采用均數±標準差(±s)的形式表示，采用單因素方差分析法分析入選孕婦年齡、孕周、血壓，以 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 入選患者的一般情況

首都醫科大學附屬北京朝陽醫院婦產科收治的孕晚期重度先兆子癇患者和正常孕足月產婦各5例。研究對象的基本情況見表1。

表1 研究對象特點Tab.1 Characteristic of the patients n=5

2.2 HLB處理血清樣本后SDS梯度膠結果

樣本條帶顯示清晰，15 000和10 000條帶可見明顯差異，但白蛋白區域條帶分離欠佳(圖1)。

圖1 HLB柱處理后的SDS-PAGE梯度膠Fig.1 SDS-PAGE treated by HLB

2.3 PLLB處理血清后SDS梯度膠結果

2組樣本顯示的條帶相似，表明處理后2組蛋白濃度無明顯改變。從PLLB洗脫后的蛋白，覆蓋蛋白的相對分子質量從10 000～200 000，一些低含量蛋白也被豐富表達，但一些含量較高的蛋白水平明顯減低，例如:血清中的白蛋白(大約在67 000左右)，詳見圖2。

2.4 通過1D-LC/MS/MS對蛋白進行鑒定

在重度先兆子癇患者中共采用HLB方法鑒定326種蛋白，采用PLLB鑒定方法1 172種蛋白;在正常妊娠婦女中共HLB方法鑒定342個蛋白，采用PLLB方法鑒定1 149個蛋白，詳見表2。

圖2 PLLB處理后SDS梯度膠Fig.2 A-SDS-PAGE gelimage treated by PLLB

表2 PLLB和HLB通過LC/MS/MS識別出的蛋白總數差異Tab.2 Total number of proteins identified by LC/MS/MS after depeletion of abundant proteins with PLLB beads and HLB cartridge

2.5 確定重度先兆子癇患者與正常妊娠對照中差異表達的蛋白

在HLB組19種蛋白上調，PLLB組30種蛋白上調;HLB組9種蛋白下調表達，PLLB組21個蛋白下調表達(見表 3，4)。

表3 HLB和PLLB處理后蛋白上調及下調數量差異Tab.3 Up-regulated proteins and down-regulated proteins by HLB and PLLB

PLLB親和層析結合1D膠-LC/MS/MS識別出的在先兆子癇患者和正常妊娠婦女孕晚期中表達有差異的血清蛋白，詳見表4。

2.6 Western blotting分析

HLB和PLLB處理血清中，表達蛋白CP。見圖2結果顯示在重度先兆子癇中，CP上升。

表4 差異血清蛋白Tab.4 Differently expressed proteins

圖3 在重度先兆子癇中ceruleplasmin上升Fig.3 Elevated level of ceruleplasmin in serum of pregnant women with severe preeclampsia

3 討論

隨著人類基因圖譜的繪制成功，蛋白質組學的出現，生物研究進入了一種后基因組時代。生物學研究從對物質活性研究為中心的時代轉化到以序列研究為基礎的時代。傳統的生物化學研究方法是先發現物質的活性，然后進行純化，然后再對其進行確認。隨著蛋白質組學的發展，2D膠聚合質譜技術對蛋白進行捕獲已從最初的假說變成了現實。但2D膠因受膠大小的限制，使很多蛋白丟失。近幾年，1D膠聯合LC/MS/MS對血清、尿液、和腦脊液等中的蛋白進行鑒定，取得了滿意的結果。

人類血清中85%表達豐富的6種蛋白(白蛋白，IgA和IgG，免疫球蛋白亞型，轉鐵蛋白，結合鐵蛋白)這些蛋白會覆蓋那些有意義但表達含量低的蛋白。故質譜檢測前需要對樣本進行處理，去除表達豐富的蛋白。使一些表達含量低，但在發病中起重要作用的蛋白充分表達，使之容易檢測和測定。

本研究應用PLLB聯合1D-LC/MS/MS分析重度先兆子癇患者和正常妊娠婦女血清中差異蛋白的表達，發現PLLB是減少血清中高表達蛋白使低表達蛋白表達豐富的有效辦法，并且有較高的重復性。用1D膠分析PLLB處理后的血清樣本，在本研究中和文獻中均獲得滿意圖像。與其他親和洗脫方法相同，PLLB可以使亞蛋白質組表達豐富，主要通過多肽六聚體選擇性與蛋白相結合。不能與多肽六聚體結合的蛋白不能保留在磁珠上。用PLLB處理血清，重度先兆子癇患者和正常妊娠婦女相比，有51種蛋白出現差異表達。

在差異表達蛋白中，有多種蛋白與急性炎性反應有關，如 ApoA2，ApoH，SAA4，CP，TRIMS，IL-17F等。在重度先兆子癇婦女血清中CP和IL-17F明顯上調。

Sacks G P等［8］通過流式細胞學研究認為，正常妊娠過程中的炎性反應是通過血清中IL-6和TNF-a濃度升高，激活中性粒細胞中的單核細胞，Cosmi L等［9］研究表明，IL-17F 來源于 CD161+，CD4+自然殺傷細胞，IL-17F作為多效性細胞因子作用在免疫和非免疫細胞上，在很多細胞上都有IL-17的受體，例如成骨細胞、纖維細胞、血管內皮細胞等［10］。IL-17配體在體外可誘導IL-6和IL-8的產生，刺激T細胞增生和很多前炎性分子的上調;進而產生一系列免疫反應，在宿主免疫防御中起到重要作用［11-12］。Borekci B等［13］研究認為先兆子癇孕婦與正常妊娠孕婦相比，血清TNF-a和IL-6濃度升高，尤其在重度先兆子癇孕婦中升高更加明顯［14］。IL-6升高只通過先升高IL-17F，然后使IL-6升高，尚需進一步驗證。循環中CP含有1 046氨基酸蛋白，查對分子質量大約在133 000［15］，是一種急性期反應蛋白，在感染、組織損傷、炎性細胞因子介導中血清明顯增高［16］。在本研究中，通過HLB和PLLB方法證明CP在重度子癇孕婦中明顯增高，并且通過Western blotting驗證，與既往研究結果相似。

先兆子癇是一種影響多器官的疾病，目前病因尚不清楚，氧化應激和炎性因子的作用引起血管內皮的損傷，導致先兆子癇及相應心血管疾病的發生，可能是一種主要的發病機制。前炎性細胞因子的主要生物活性，包括炎性反應和對內皮細胞活性的影響，先兆子癇患者血清中炎性因子的增加，可能是引起疾病癥狀的原因，也可能是疾病發生后產生的結果。

總之，本研究結果表明，PLLB結合1D-LC/MS/MS分析重度先兆子癇患者與正常妊娠婦女血清中差異表達蛋白是一種有效地方法，一些急性反應因子可能與先兆子癇的發病機制相關。

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