細(xì)菌16SrRNA基因PCR診斷細(xì)菌性陰道病的研究

呂 治 彭國麗 蘇建榮*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院檢驗(yàn)中心，北京 100050;2.北京市公安醫(yī)院醫(yī)療技術(shù)處，北京 100121)

細(xì)菌性陰道病(bacterial vaginosis，BV)是陰道細(xì)菌生態(tài)平衡被打破，占優(yōu)勢(shì)的乳酸桿菌減少而陰道加德納菌、厭氧菌大量繁殖，導(dǎo)致搔癢、分泌物增多并帶魚腥臭味的臨床綜合征。細(xì)菌性陰道病的病因尚不清楚，目前認(rèn)為是多種微生物共同作用的結(jié)果。BV相關(guān)微生物包括:陰道加德納菌、陰道阿托波菌、動(dòng)彎桿菌及人型支原體等。這些細(xì)菌多為厭氧菌或苛氧菌，常規(guī)分離培養(yǎng)較困難。細(xì)菌16SrRNA基因PCR技術(shù)在臨床微生物和感染性疾病病原體鑒定的廣泛應(yīng)用為確定BV及建立BV的分子診斷方法提供了可能［1］。

本研究采用細(xì)菌16SrRNA基因特異性引物PCR對(duì)陰道分泌物標(biāo)本中的2種乳酸桿菌:卷曲乳酸桿菌(lactobacillus crispatus)、惰性乳酸桿菌(lactobacillus iners)和9種BV相關(guān)條件致病菌:陰道加德納菌(gardnerella vaginalis)、陰道阿托波菌(atopobium vaginae)、纖毛菌屬(leptotrichia sp)、巨球菌屬(megasphaera sp)、羞怯動(dòng)彎桿菌(mobiluncus mulieris)、柯氏動(dòng)彎桿菌(mobiluncus curtisii)、人型支原體(mycoplasma hominis)、脆弱擬桿菌(bacteroides fragilis)、普雷沃菌屬(prevotella sp)進(jìn)行檢測(cè)。通過對(duì)兩組標(biāo)本中細(xì)菌分離率的比較，確定BV主要角色菌，建立BV的分子診斷方法。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

BV組91例，為北京友誼醫(yī)院、北京市房山區(qū)婦幼保健院、北京市朝陽婦幼保健院就診的育齡期婦女，年齡18～45歲，除外淋球菌、梅毒等性傳播疾病及真菌、滴蟲等特異性陰道感染性疾病。按照臨床診斷BV的Amsel標(biāo)準(zhǔn)的4項(xiàng)內(nèi)容檢查:分泌物外觀、pH值、胺試驗(yàn)、線索細(xì)胞。4項(xiàng)中有3項(xiàng)陽性診斷為BV。健康對(duì)照組82例為健康體檢的育齡期婦女，除外細(xì)菌性、滴蟲性、真菌性陰道疾病，除外梅毒、淋病等性傳播疾病。

1.2 標(biāo)本采集

用無菌棉拭子在患者陰道壁下1/3處采集分泌物，放入無菌試管中立即送檢。

1.3 試劑

細(xì)菌基因組DNA試劑盒(Bacterial DNA Kit)，OMEGA公司產(chǎn)品。瓊脂糖，北京賽百盛基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品。PCR Taq Mix，廣州東盛生物科技有限公司產(chǎn)品。2×PCR TaqMix的組分:100 mmol/L KCl，20 mmol/L Tris-HCl，3 mmol/L MgCl2，400 mmol/L dNTP混合物，0.1 U/μL Taq DNA 聚合酶，溴酚藍(lán)等。

1.4 儀器

ABI7300PCR分析儀(美國ABI公司)、DYY-10C型電泳儀(北京六一儀器廠)、BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)。

1.5 細(xì)菌基因組DNA提取

棉拭子在PBS緩沖液中振蕩懸浮，12 000 r/min離心5 min，收集菌體沉淀。按照DNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組DNA，－70℃冷凍保存。

1.6 細(xì)菌特異性16SrRNA基因PCR檢測(cè)

25 μL 反應(yīng)體系，包括引物各 1 μL(10 μmol/L)、TaqMix 12.5 μL、模板 2 μL，超純水補(bǔ)足體積。PCR引物序列、反應(yīng)條件及產(chǎn)物片段見表1。

表1 細(xì)菌特異性16SrRNA基因PCR引物序列、反應(yīng)條件及產(chǎn)物片段Tab.1 Bacteria targets，primers，and PCR conditions for each bacterium-specific 16SrRNA PCR assay

L.crispatus:Lactobacillus crispatus;L.iners:Lactobacillus iners;G.vaginalis:Gardnerella vaginalis;A.vaginae:Atopobium vaginae;Leptotrichia/Sneathia spp:Leptotrichia/Sneathia spp;Megasphaera sp:Megasphaera sp;M.mulieris:Mobiluncus mulieris;M.curtisii:Mobiluncus curtisii;M.hominis:Mycoplasma hominis;B.fragilis:Bacteroides fragilis;Prevotella sp:Prevotella sp.

1.7 產(chǎn)物分析

擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中(含0.15 mg/L溴化乙啶)100 V電壓電泳30～40 min，全自動(dòng)凝膠圖像分析系統(tǒng)顯像觀察。符合片段大小的PCR陽性產(chǎn)物經(jīng)切膠回收純化后由上海英峻生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過BLAST與Gene Bank比對(duì)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

11種細(xì)菌16SrRNA基因PCR檢測(cè):在82份健康對(duì)照組標(biāo)本中，分離率最高的3種細(xì)菌是卷曲乳酸桿菌61.0%(50/82)、惰性乳酸桿菌52.4%(43/82)、陰道加德納菌45.1%(37/82)，而91份BV患者標(biāo)本中，分離率居前3位的細(xì)菌分別是，陰道加德納菌屬63.7%(58/91)、普雷沃菌屬63.7%(58/91)、陰道阿托波菌屬51.6%(47/91)。說明BV患者陰道菌群構(gòu)成發(fā)生了顯著變化，作為陰道主要優(yōu)勢(shì)菌的乳酸菌大量耗竭，厭氧菌、陰道加德納菌過度繁殖，詳見表1。

通過對(duì)2組標(biāo)本11種細(xì)菌分離率的比較顯示，一些苛養(yǎng)細(xì)菌或非培養(yǎng)細(xì)菌與BV的發(fā)生密切相關(guān)。這些細(xì)菌用常規(guī)培養(yǎng)方法很難分離，采用PCR方法檢測(cè)陰道阿托波菌屬，纖毛菌屬，巨球菌屬，羞怯動(dòng)彎桿菌屬，以陽性檢測(cè)結(jié)果作為BV診斷指標(biāo)時(shí)，其診斷特異性分別為 85.4%、93.9%、95.1%、91.4%。

以表2中差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的陰道阿托波菌屬、羞怯動(dòng)彎桿菌屬、普雷沃菌屬、纖毛菌屬、巨球菌屬選擇3種細(xì)菌進(jìn)行組合。以任意1種細(xì)菌陽性作為BV診斷指標(biāo)，以3者均陰性為排除指標(biāo)，與臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較評(píng)價(jià)見表3。結(jié)果顯示:聯(lián)合檢測(cè)陰道阿托波菌屬、普雷沃菌屬、纖毛菌屬，特異性為93.41%，敏感性為 78.05%，OR=50.37，是 PCR 方法診斷BV的較理想方案。

卷曲乳酸桿菌是正常陰道菌群的主要優(yōu)勢(shì)菌，是產(chǎn)生過氧化氫的主要細(xì)菌，對(duì)于維持陰道微生態(tài)平衡，抑制病原微生物生長(zhǎng)繁殖起著關(guān)鍵作用。該菌在健康組的分離率為61.0%(50/82)，在BV患者卷曲乳酸桿菌大量耗竭，分離率42.9%(39/91)，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。顯示卷曲乳酸桿菌與BV呈負(fù)相關(guān) (OR=0.480)。惰性乳酸桿菌是另一種在陰道中分離率較高的乳酸桿菌，PCR檢測(cè)結(jié)果顯示在BV組(38.5%)和健康組(52.4%)均有較高的分離率，但2組標(biāo)本的分離率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

陰道加德納菌可在63.7%的 BV患者標(biāo)本和45.1%的健康對(duì)照標(biāo)本中分離到。盡管2組分離率的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但是由于其對(duì)BV診斷的特異性較差，單獨(dú)對(duì)該菌進(jìn)行定性檢測(cè)尚不能作為判斷BV的理想指標(biāo)。

動(dòng)彎桿菌屬的柯氏動(dòng)彎桿菌和羞怯動(dòng)彎桿菌是一種厭氧、革蘭染色不定的苛養(yǎng)小桿菌。動(dòng)彎桿菌屬的柯氏動(dòng)彎桿菌和羞怯動(dòng)彎桿菌在BV組的分離率分別為28.6%和41.8%，敏感性較差;但診斷特異性較高，分別為 85.3%和 91.5%。

人型支原體、脆弱擬桿菌、惰性乳酸桿菌在BV組和健康組的分離率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。11種陰道細(xì)菌2%瓊脂糖凝膠電泳見圖1;健康組、BV組細(xì)菌分離率比較見表2。

圖1 11種陰道細(xì)菌PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoretic profile of 11 Vaginal Bacteria PCR products

表2 BV組、健康組11種陰道細(xì)菌PCR檢測(cè)結(jié)果Tab.2 11 Bacterial PCR results between BV group and healthy group n(%)

表3 不同細(xì)菌檢測(cè)組合診斷BV價(jià)值評(píng)價(jià)Tab.3 Evaluation of different bacteria combination in diagnosis of BV n(%)

3 討論

本研究采用16SrRNA基因細(xì)菌特異性PCR技術(shù)對(duì)陰道分泌物標(biāo)本中的11種與BV關(guān)系密切的細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)。這些細(xì)菌主要是厭氧菌、苛養(yǎng)菌和一些新發(fā)現(xiàn)的非培養(yǎng)細(xì)菌。常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)不能有效地進(jìn)行分離鑒定，而PCR技術(shù)具有敏感性高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)⒊Ｒ?guī)培養(yǎng)無法檢測(cè)的細(xì)菌識(shí)別出來。盡管本研究采用的16SrRNA基因細(xì)菌特異性引物不能檢測(cè)未知細(xì)菌，但能夠準(zhǔn)確測(cè)定已知細(xì)菌在陰道中的分離率，這是進(jìn)一步研究陰道細(xì)菌數(shù)量及相互關(guān)系的前提。

本研究顯示，與健康對(duì)照組相比，BV患者陰道菌群構(gòu)成發(fā)生了明顯變化，分離的11種細(xì)菌中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的(P＜0.05)占8種。一些常規(guī)培養(yǎng)方法不能發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌如:巨球菌屬、纖毛菌屬、陰道阿托波菌、羞怯動(dòng)彎桿菌等證實(shí)與BV密切相關(guān)，可作為BV的標(biāo)志菌。當(dāng)聯(lián)合檢測(cè)陰道阿托波菌屬、普雷沃菌屬、纖毛菌屬(以檢出任一種細(xì)菌為BV陽性指標(biāo)，均未檢出作為BV陰性指標(biāo))時(shí)，以Amsel診斷標(biāo)準(zhǔn)作為金標(biāo)準(zhǔn)，敏感性為93.41%，特異性為78.05%。可見，利用PCR技術(shù)檢測(cè)BV關(guān)鍵細(xì)菌或細(xì)菌組合可以建立有效的BV診斷方法。

除上述BV標(biāo)志菌外，本研究顯示卷曲乳酸桿菌是陰道中的優(yōu)勢(shì)菌，其在BV組分離率明顯降低，提示該菌與BV的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，屬保護(hù)性因素(OR=0.480)。惰性乳酸桿菌是一種在陰道微生態(tài)環(huán)境惡化時(shí)仍能存活的獨(dú)特的乳酸桿菌，其在陰道防御機(jī)制中的作用是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)［4］。在可培養(yǎng)細(xì)菌中，陰道加德納菌和動(dòng)彎桿菌或者由于缺乏特異性，或者因敏感性差都不是BV診斷的理想檢測(cè)指標(biāo)。人型支原體、脆弱擬桿菌的分離率在2組標(biāo)本中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示應(yīng)做進(jìn)一步的定量分析將更具有意義。

本研究采用的定性PCR方法不能夠提供標(biāo)本中細(xì)菌數(shù)量的信息，本研究也未能對(duì)全部已知的陰道細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)。相對(duì)于定性檢測(cè)BV致病菌的有無，檢測(cè)細(xì)菌數(shù)量對(duì)于BV的診斷似乎更有意義，但是由于熒光定量PCR存在對(duì)產(chǎn)物片段大小的限制，不能獲得足夠的產(chǎn)物信息。本研究采用常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)合序列分析可以保證PCR產(chǎn)物均為所需的目的片段，從而提高了細(xì)菌檢測(cè)的準(zhǔn)確性。雖然目前國內(nèi)外學(xué)者對(duì)于分子生物學(xué)技術(shù)診斷BV的具體方案仍存在爭(zhēng)議，但這些研究拓展了分子診斷學(xué)的應(yīng)用，對(duì)闡明細(xì)菌性陰道病的病因?qū)W具有重要意義［3，6］。

［1］田竟生，徐群淵.PCR及其相關(guān)技術(shù)進(jìn)展［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，16(2):159-161.

［2］Jill E.Clarridge.Impact of 16S rRNA Gene Sequence A-nalysis for Identification of Bacteria on Clinical Microbiology and Infectious Diseases［J］.Clinical Microbiology Reviews，2004，17(4):840-862.

［3］Fredricks D N，F(xiàn)iedler T L，Thomas K K，et al.Targeted PCR for Detection of Vaginal Bacteria Associated with Bacterial Vaginosis［J］.J Clin Micrology，2007，45(10):3270-3276.

［4］Backer E D，Verhelst R，Verstraelen H，et al.Quantitative determination by real-time PCR of four vaginal Lactobacillus species，Gardnerella vaginalis and Atopobium vaginae indicates an inverse relationship between L.gasseri and L.iners［J］.BMC Microbiology，2007，9(7):115-121.

［5］Matsuki T，Watanabe K，F(xiàn)ujimoto J，et al.Development of 16S rRNA-gene-targeted group-specific primers for the detection and identification of predominant bacteria in human feces applied and environmental micrology［J］.Appl Environ Microbiol，2002，68(11):5445-5451.

［6］Kumar N，Behera B，Sagiri S S，et al.Bacterial vaginosis:etiology and medalities of treatment-A brief note［J］.J Pharm Bioallied Sci，2011，3(4):496-503.