探討γ－谷氨?；D移酶冰凍混合人血清候選標準物質的制備和穩定性

徐 靜 張建平 王清濤

(首都醫科大學附屬北京朝陽醫院檢驗科，北京 100020)

血清酶測定是臨床實驗室的一項重要常規工作，但由于酶的催化活性不僅取決于酶的含量，還受多種因素的影響，具有方法依賴性，對酶活性測定進行標準化是解決這一問題的最好方法［1］。目前，國際臨床化學學會(International Federation of Clinical Chemistry，IFCC)已經公布了丙氨酸氨基轉移酶(alanine-aminotransferase，ALT)、門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate-aminotransferase，AST)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、γ-谷氨酰轉移酶(gamma-glutamyltransferase，GGT)、淀粉酶(amylase，AMY)6個血清酶測定的參考方法［2-7］。在標準物質方面，目前歐共體標準物質與測量研究所(Institute for Reference Materials and Measurements，IRMM)以及日本臨床檢驗標準委員會(Japan Committee for Clinical Laboratory Standards，JCCLS)均研制了酶的有證標準物質。國內多家實驗室已經建立了酶的國際臨床化學聯合會(International Federation of Clinical Chemistry，IFCC)推薦的參考方法，酶學標準物質的研制也在進行中，考慮到互通性，酶學標準物質最好為人源性血清標本，而用冰凍人血清制備標準物質的可行性也得到了美國國家疾病控制中心的認可［8］。本實驗室將收集的人血清按照GGT不同濃度進行過濾分裝，制備了GGT冰凍混合人血清候選標準物質，并對其穩定性進行了觀察，以研究此血清制備方法的可行性和GGT冰凍混合血清－80℃貯存條件下的穩定性。

1 材料與方法

1.1 GGT冰凍混合人血清的制備

①體檢血清:收集當日體檢結果正常，且無溶血、黃疸及乳糜的血清標本，－80℃冰箱保存。②患者血清:按 GGT結果50～200 U/L、200～400 U/L、400～750 U/L、＞750 U/L濃度范圍分別收集患者新鮮血清，避免溶血、黃疸及乳糜。－80℃冰箱保存。

1.2 儀器

GAST DOA型真空/加壓兩用過濾泵(美國)，全波過濾器，分析濾紙，賽多利斯0.8 μm醋酸纖維素膜(德國Sartorius公司)，賽多利斯0.45 μm醋酸纖維素膜(德國 Sartorius公司)，賽多利斯 0.2 μm 醋酸纖維素膜(德國 Sartorius公司)，BIOHIT 100 ～5 000 μL 單道電動移液器(芬蘭)，凍存盒，磁力攪拌器，Siemens Dimension RXL Max全自動生化分析儀。

1.3 冰凍混合人血清制備方法

1)確定濃度:制備5個濃度水平的GGT冰凍混合人血清候選標準物質，各濃度分別為＜50 U/L、50～100 U/L、101 ～200 U/L、201 ～300 U/L、301 ～400 U/L，每個濃度水平制備約600 mL。分裝1 mL/支，每個濃度約500支。

2)血清復融:在過濾前一天將需要過濾的血清在室溫融化，將收集的同一濃度范圍的血清混勻，用常規方法測定其濃度。根據其濃度水平確定最終混合比例，再用常規方法測定其濃度，達到確定的濃度水平后放4℃冰箱保存。

3)玻璃器皿及凍存管:將過濾用的容器洗刷干凈，與凍存管一同消毒后備用。

4)將前一天融好的血清從4℃冰箱中取出，在生物安全柜中進行負壓抽吸過濾，血清依次經過分析濾紙，0.8 μm 濾膜，0.45 μm 濾膜，0.2 μm 濾膜過濾。

5)將過濾好的血清在生物安全柜中進行分裝，1 mL/支。－80℃冰箱保存。

1.4 冰凍混合人血清候選標準物質的穩定性觀察

1)材料:①GGT冰凍混合人血清候選標準物質:經過濾分裝制備的5個濃度水平的混合人血清。②質控血清:RANDOX常規化學質控血清1和2(批號分別為496UN和331UE)，分別將其進行0.5 mL/支分裝，用于監測儀器及試劑狀態。③儀器和試劑:Siemens Dimension RXL Max全自動生化分析儀，Siemens GGT檢測試劑盒，Siemens enzyme校準品。

2)方法:分別于候選標準物質制備后0、7、30、60、120、180、330、360、390、750 d 采用 Siemens Dimension RXL Max全自動生化分析儀測定RANDOX質控血清1、2(QC1、QC2)及采用隨機方法抽取的5個濃度水平的候選標準物質各1支，分別記錄為 C1、C2、C3、C4、C5。

1.5 統計學方法

采用Microsoft Office Excel 2007軟件抽取隨機樣本并進行趨勢分析，采用SPSS 11.5統計學軟件進行線性回歸分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

RANDOX質控血清QC1、QC2和候選標準物質C1、C2、C3、C4、C5 在 0、7、30、60、120、180、330、360、390、750 d的測定結果見表1。

表1 RANDOX質控血清和候選標準物質GGT測定結果Tab.1 RANDOX qc serum and candidate standard material GGT determination result (U/L)

RANDOX質控血清和候選標準物質穩定性曲線見圖1，從圖1可以看到對于經驗模型方法，QC1、QC2、C1～C5的斜率 b分別為 －0.127 8，－0.442 4，0.060 6，－0.042 4，－0.084 8，0.484 8，0.006 1，均接近0，即質控血清和候選標準物質在不同時間的GGT測定結果沒有明顯變化趨勢。

根據ISO Guide35，采用SPSS 11.5統計學軟件對QC1、QC2、C1～C5進行線性回歸分析，結果顯示在750 d以內，QC1、QC2、C1～C5線性回歸分析的 P 值均 ＞0.05(QC1、QC2、C1 ～C5測定結果P值分別為0.560、0.114、0.886，0.753，0.585，0.571，0.945)，即差異不具有統計學意義，所以GGT冰凍混合人血清候選標準物質在此時間階段是穩定的。

圖1 GGT冰凍混合人血清候選標準物質的穩定性Fig.1 Stability of GGT frozen mixed human serum candidate standard material

3 討論

臨床檢驗結果準確一直是檢驗醫學界的工作目標。實現檢驗結果準確的重要手段是建立和保證檢驗結果的溯源性，而開展檢驗量值溯源的必要條件是具備參考系統［9］，后者包括參考測量程序，從事參考測量的實驗室及參考物質。而由參考方法定值，具有不同水平參考值結果的患者混合血清盤可以作為“企業一級參考品”，即企業的最高標準。這種定值血清分裝成小包裝，－70℃保存，應該與新鮮血清性質相似，但對其穩定性的研究甚少。從減少基質效應的角度出發，校準品最好為人源血清標本。

采用感染篩查陰性的人血清或類人血清標本，添加外源性替代物，如加入與人血清酶具有相似特性，從動物臟器中提取的酶或重組人源性酶制品制備校準品具有基質效應小、良好的互換性和感染可能性小等優點而成為一種可行的方案［10］。本實驗室制備的GGT冰凍混合人血清候選標準物質的血清來源為實驗室檢測剩余的體檢者及患者血清，主要存在的問題是來源有限及可能具有感染性，最好在對收集的血清混勻后測定HIV和肝炎標志物，以進行感染篩查，而本研究并未進行此測定。但本實驗室采用的混合血清制備方法比較簡單，除生物安全柜外，無需特殊設備，可操作性強。

穩定性觀察分為短期穩定性和長期穩定性，有2種基本實驗設計，即經典穩定性研究和同步穩定性研究，經典穩定性研究中，同時(如同一批次)制備的樣品在同樣的條件下隨著時間變化進行測量，同步穩定性研究是使所有穩定性研究的測量在重復性條件下進行，其不確定度相對較?。?1］。本實驗室曾采用同步穩定性研究方法進行6種冰凍混合血清酶(ALP、ALT、AST、GGT、CK、LDH)的短期穩定性觀察，對于GGT，其在室溫和2℃ ～8℃冷藏條件下30 d內穩定［12］。對于長期穩定性的觀察，我們采用經典穩定性研究方法，并采用直線作為經驗模型，即斜率b應為0或接近0的方法觀察，結果發現，5個濃度水平GGT混合血清在不同時間的測定結果沒有明顯變化趨勢。采用線性回歸方差分析方法對其進行分析，得到相同的結果，因此在750d穩定性的觀察中，5個濃度水平的GGT冰凍混合人血清候選標準物質在－80℃保存條件下是穩定的。

綜上所述，雖然本實驗室在血清來源方面缺乏感染篩查，無法保證制備的混合血清候選標準物質不存在感染性，但采用的混合血清制備方法簡便易行，且制備候選標準物質穩定性良好。此血清候選標準物質制備方法及穩定性研究方案可以應用于其他項目，但須注意感染性問題，因此血清來源仍是一個需要解決的問題。

［1］張克堅，楊振華.臨床酶學標準化的新途徑［J］.中華醫學檢驗雜志，1999，22(1):54-56.

［2］Schumann G，Bonora R，Ceriotti F，et al.IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 degrees C.Part 2.Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of creatine kinase［J］.Clin Chem Lab Med，2002，40(6):635-642.

［3］Schumann G，Bonora R，Ceriotti F，et al.IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 degrees C.Part 3.Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of lactate dehydrogenase［J］.Clin Chem Lab Med，2002，40(6):643-648.

［4］Schumann G，Bonora R，Ceriotti F，et al.IFCC primary reference procedures for the measurement o f catalytic activity concentrations of enzymes at 37 degrees C.Part 4.Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of alanine aminotransferase［J］.Clin Chem Lab Med，2002，40(7):718-724.

［5］Schumann G，Bonora R，Ceriotti F，et al.IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activi-ty concentrations of enzymes at 37℃.Part 5.Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of aspartate aminotransferase［J］.Clin Chem Lab Med，2002，40(7):725-733.

［6］Schumann G，Bonora R，Ceriotti F，et al.IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37℃.Part 6.Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of γ-glutamyltransferase［J］.Clin Chem Lab Med，2002，40(7):734-738.

［7］Schumann G，Aoki R，Ferrero C A，et al.IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37℃.Part 8.Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of α-Amylase［J］.Clin Chem Lab Med，2006，44(9):1146-1155.

［8］National Committee for Clinical Laboratory Standards.Preparation and Validation of Commutable Frozen Human Serum Pools as Secondary Reference Materials for Cholesterol Measurement Procedures;Approved Guideline［S］.C37-A.Wayne，PA:NCCLS:1999.

［9］陳文祥.臨床檢驗量值溯源與參考系統［J］.中華檢驗醫學雜志，2006，29(1):17-19.

［10］徐國賓，吳南，王清濤.要重視血清酶學測定的標準化工作［J］.臨床檢驗雜志，2007，25(3):161-164.

［11］中國合格評定國家認可委員會.CNAS-CL04 2007標準物質/標準樣品生產者能力認可準則［S］.2007.

［12］馬懷安，王清濤，徐靜，等.六種冰凍混合血清酶學的短期同步穩定性研究［J］.中國醫藥導刊，2009，11(4):644-646.