抗念珠菌藥物的耐藥特性分析

曾昭瑛 蘇建榮

(首都醫科大學附屬北京友誼醫院臨床檢驗中心，北京 100050)

隨著廣譜抗生素和免疫抑制劑的廣泛使用，免疫功能缺陷患者的不斷增多及有創性診斷和治療技術的大量應用，導致侵襲性真菌感染日益增多［1－2］。念珠菌菌屬是最常見的致病真菌，它能引起的感染是多種多樣的，可累及全身各個臟器，從皮膚黏膜感染直至危及生命的系統性感染［3］。與此同時，由于抗真菌藥大量和長期的預防性及治療性應用，念珠菌耐藥菌株相繼出現，給臨床治療帶來了一定的困難［4］。為此，本文旨在介紹抗念珠菌藥物的特點、藥物敏感性試驗方法和要求、國內外耐藥現狀及念珠菌感染治療選藥推薦等內容。

1 抗念珠菌藥物與耐藥表型檢測

目前常用的抗念珠菌的藥物，按結構類型的不同可分為以下幾類:①多烯類:這類藥物通過與真菌細胞膜上的麥角固醇結合，使細胞膜形成微孔，改變膜的通透性，從而引起細胞內物質的外滲，導致真菌死亡［5］。該類臨床常用藥包括兩性霉素B及其脂質體。兩性霉素B為最重要的廣譜抗真菌藥物之一，幾乎對所有真菌都有較強的抗菌活性，目前仍是治療多種深部真菌病的首選藥物［6］。② 唑類:這類藥物通過抑制細胞色素P450依賴酶，使麥角固醇合成受阻從而破壞了真菌細胞的完整性［7］。代表藥物有氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑等。氟康唑主要用于全身性和黏膜念珠菌病，也可用于那些由于免疫功能低下而容易發生念珠菌病的患者的預防治療［8］，氟康唑具有口服吸收好、抗菌譜廣，無嚴重不良反應等特點，目前成為公認安全有效的抗真菌藥［9］。③ 嘧啶類:這類藥物通過選擇性地進入細胞內，在胞嘧啶脫氨酶的作用下轉化為氟尿嘧啶進而取代RNA中的尿嘧啶，干擾了念珠菌正常蛋白質的合成，從而達到抗念珠菌的作用。5－氟胞嘧啶單獨使用易產生耐藥性［10］，宜與兩性霉素B同時使用，兩者聯合應用治療念珠菌及隱球菌感染［11］可起協同作用，尤以白色念珠菌感染時這種協同作用更為明顯［12］。④ 棘白菌素類:該類藥物為β－(1，3)葡聚糖合成酶抑制劑，通過抑制或干擾β－(1，3)葡聚糖的合成可以有效地抑制和殺滅念珠菌，由于哺乳動物沒有細胞壁，因此，這類藥物可選擇性作用于念珠菌?？ú捶覂羰堑谝粋€被美國食品及藥物管理局批準上市的作用于真菌細胞壁的藥物，主要用于發熱、中性粒細胞減少患者真菌感染的經驗性治療［13］。

隨著念珠菌感染的增多及抗真菌藥物的廣泛使用，念珠菌的耐藥現象日趨嚴重［4］。因此，快速而準確地對念珠菌進行藥物敏感性試驗，篩選出敏感藥物以指導臨床合理用藥，減少耐藥發生為目前臨床所急需。目前用來評價藥物敏感性的基本方法之一，就是測定藥物的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，其標準化方面已取得很大進展。

1.1 美國臨床實驗室標準化委員會(Clinical Laboratory Standards Institute，CLSI)藥物敏感性試驗方案［14］

美國臨床實驗室標準化委員會于1982年成立了真菌藥物敏感性試驗分會，選擇了液體培養基稀釋法對念珠菌和新型隱球菌進行標準化藥物敏感性試驗(簡稱藥敏試驗)研究。1992年，起草了《酵母菌的液體培養基稀釋法抗真菌藥物敏感試驗參考方案》，即M27－P，用于檢測引起深部感染的酵母菌，包括念珠菌和新生隱球菌等菌對兩性霉素B、5－氟胞嘧啶和唑類藥物(氟康唑、酮康唑及伊曲康唑)的敏感性。1995年，該草案進行了修訂，增加了經濟、簡便的微量稀釋法，即M27－T，隨后的2年中，又對藥物的MIC臨界點判定方法進行了修訂，形成M27－A，確定了念珠菌對氟康唑、伊曲康唑、5－氟胞嘧啶的MIC折點。2002年，CLSI就微量稀釋法中24 h及48 h的MIC判定試驗方法進行了統一，同時增加了新的抗真菌藥物泊沙康唑、雷夫康唑和伏立康唑的試驗方法及 MIC參考范圍，并將該方案修訂出版，即M27－A2。2008年，CLSI又發表了真菌體外藥物敏感性試驗的標準，即M27－A3和M27－S3文件，增加了對伏立康唑、卡泊芬凈、米卡芬凈、阿尼芬凈體外藥物敏感性試驗的判定折點。新指南也公布了念珠菌屬對常見抗真菌藥物的敏感性。

CLSI M27－A3方案的肉湯微量稀釋法目前應用的比較廣泛，故簡單介紹以下其具體操作過程:

(1)RPMI1640培養基配制:L－谷氨酰胺及酚紅指示劑，不含碳酸氫鈉，0.2%葡萄糖，以0.165 mol/L嗎啉丙烷磺酸為緩沖液調整pH值到7.0。加熱溶解后經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，再往此 RPMI1640液體中加入高壓滅菌已融化的瓊脂溶液，使最終瓊脂含量0.5 g/L，以備微量稀釋法測定MIC用。

(2)接種菌液準備:取在沙保羅培養基上轉種48 h的念珠菌菌落，用0.85%無菌0.9%氯化鈉注射液制成約0.5麥氏比濁度的菌懸液，約1×106～5×106CFU/mL。

(3)藥物敏感性試驗操作流程:無菌96孔U型塑料板每排第1～11孔加入100 μL用RPMI1640培養基倍比稀釋的2倍于待測抗真菌藥物濃度的藥液，每排最后1孔(第12孔)只加100 μL培養基不加藥作為生長對照孔。取0.5麥氏比濁度的菌懸液用RPMI1640培養基1 000倍稀釋后作為待接種物，此時接種物濃度為1×103～5×103CFU/mL。取此接種物加至微孔板中，每孔100 μL，使得最終濃度達到0.5×103～2.5×103CFU/mL。將試驗板放置35℃，孵育48 h。

(4)結果判讀:24 h和48 h判讀，與對照孔按下列標準比較，0:肉眼觀察清晰;1:輕度模糊;2:濁度顯著減低(約50%被抑制);3:濁度輕度減低;4:濁度不減低。兩性霉素B以肉眼觀察清晰不混濁，即生長完全受抑制為MIC判定終點;5－氟胞嘧啶、唑類藥物以及棘白菌素類藥物以濁度顯著減低(約50%被抑制)孔(2分)為MIC判斷終點。具體的MIC判讀標準詳見表1。

表1 念珠菌體外藥物敏感性試驗的MIC判讀標準Tab.1 Interpretive guidelines for in vitro susceptibility testing of candida spp(μg·mL－1)

(5)用質控菌株進行對照:克柔假絲酵母菌 ATC－ C?6258、近平滑假絲酵母菌 ATCC?22019。質控菌株的MIC允許范圍詳見表2［15］。

表2 2株質量控制菌株用于肉湯微量稀釋法質量控制24和48 h MIC允許范圍Tab.2 Recommended 24 and 48 h MIC limits for two quality control strains for broth microbilution

值得注意的是，克柔假絲酵母菌對氟康唑天然耐藥［16］，故在判讀結果時不應采用CLSI給出的判讀標準，在報告藥敏時，直接報告氟康唑耐藥。目前的CLSI文件沒有給出兩性霉素B的折點，臨床研究利用CLSI提供的念珠菌參考藥敏方法所得出的MIC值密集于 0.25 ～1.00 μg/mL［17］，若 MIC ＞1 μg/mL，則考慮兩性霉素B耐藥。棘白菌素類藥物的MIC值必須在24 h讀取。

1.2 歐洲藥物敏感性試驗委員會(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)真菌藥物敏感性試驗方案

歐洲藥物敏感性試驗委員會真菌藥物敏感性試驗方案與 CLSI M27－A3相比略有差別［18］，但基本操作流程相同。存在區別的地方是:EUCAST所用的RPMI1640培養基所含葡萄糖的量為2%，CLSI為0.2%;EUCAST采用的微量稀釋藥敏板為平底，CLSI為U型;EUCAST接種時的菌量為0.5×105～2.5×105CFU/mL，CLSI為 1×103～5×103CFU/mL;EUCAST的MIC判讀時間為24 h，CLSI為24 h和48 h;EUCAST的結果判讀借助分光光度計于波長530～550 nm下進行，而CLSI靠肉眼觀察。EUCAST采用2%的葡萄糖使得生長對照空的濁度更明顯，而MIC值可在24 h內獲得。一項比較EUCAST和CLSI真菌藥物敏感性試驗的多中心研究［19］指出:EUCAST真菌藥物敏感性試驗所得的三唑類藥物的MIC值要低于CLSI參考方法。因此，不能用CLSI的真菌藥敏折點去評價EUCAST方法所得的MIC值。

1.3 E-試驗法［20］

E－試驗法是一種改良的瓊脂擴散法，以試劑條的形式定量讀出MIC值。比傳統的紙片擴散法測量抑菌圈的大小精確可靠，易于操作。其原理和方法是先將藥物按log2梯度遞減稀釋成不同濃度，并固定于特制的5 mm×50 mm的塑料條上，塑料條反面標記相應的藥物濃度數字，試驗時用無菌棉棒蘸0.5麥氏濁度定量菌懸液均勻涂布于含有1.5%RPMI1640瓊脂平板表面，干燥15 min后，再將試劑條含藥面貼在瓊脂平面。經35℃孵育48 h。孵育后，由于藥物在瓊脂內的彌散作用和對真菌的抑制活性，可在試劑條周圍形成一個圓形或橢圓形的抑菌圈，其邊緣與試劑條交界處可定量讀出MIC值［21］。

1.4 生物梅里埃ATB-Fungus微量稀釋法

該法目前在各大臨床實驗室應用廣泛。其操作過程為［22］:將念珠菌菌落混懸于無菌0.9%氯化鈉注射液中，使其濃度為2麥氏比濁度。取20 μL菌懸液加入ATB培養基中混勻，再用微量移液器將此菌液加入藥敏板中，每孔135 μL，蓋上塑料蓋，置35℃孵育24～48 h。以生長對照孔生長良好，而含藥最高稀釋孔不生長者為最小抑菌濃度。該法采用的是CLSI M27－A2方案規定的耐藥菌株判定標準:氟康唑≤0.125 μg/mL 為敏感，≥1 μg/mL 為耐藥;伊曲康唑≤0.125 μg/mL 為敏感，0.25 ～0.5 μg/mL 為劑量依賴性敏感，≥1 μg/mL 為耐藥;5－氟胞嘧啶≤4 μg/mL為敏感，8 ～16 μg/mL 為劑量依賴性敏感，≥32 μg/mL為耐藥。

1.5 丹麥 Rosco紙片法［23］

將改良的Shadomy瓊脂培養基加熱熔解后倒入直徑為90 mm的無菌培養皿中，35℃干燥20～30 min。用無菌棉簽將0.5麥氏比濁度的菌懸液均勻涂布于Shadomy瓊脂平板上經35℃干燥10 min后貼上丹麥Rosco公司生產的真菌藥敏紙片，35℃孵育24 h用游標卡尺測量抑菌圈大小(抑菌環邊緣少量菌落生長忽略不計)。Rosco紙片擴散法參考標準敏感≥21 mm，耐藥≤10 mm，10 mm＜中介＜21 mm。

2 國內外抗念珠菌藥物的耐藥現狀

2008～2009年SENTRY社區和醫院感染念珠菌血癥菌種分布及耐藥性監測報告［24］顯示，2 085株來自亞太地區、拉丁美洲、歐洲和北美洲的念珠菌中，阿尼芬凈的耐藥率為2.4%，米卡芬凈為1.9%，而唑類藥物的耐藥率為3.5% ～5.6%，且多發生于光滑假絲酵母菌。念珠菌對抗真菌藥物耐藥機制主要有:①藥物作用靶位改變;②念珠菌細胞內藥物累積減少;③代謝途徑改變;④念珠菌生物膜形成。各種耐藥機制既可以單獨起作用，又可以兩種或多種機制同時作用。菌株呈高度耐藥常常為多種耐藥機制共同作用的結果［25］。Perea S等［26］對耐藥白色念珠菌的流行病學調查發現:85%的耐藥株為外排泵過度表達;65%和35%的耐藥株為藥物靶向酶改變或過度表達;75%的耐藥株為多因素聯合耐藥。下面將對臨床常用的一些抗真菌藥的耐藥現狀進行簡單介紹。

2.1 多烯類抗念珠菌藥:兩性霉素B

若念珠菌胞膜上麥角甾醇的量和/或質發生改變，或被其他甾醇所代替，則兩性霉素B不能發揮作用。如釀酒酵母菌變異后菌膜中固醇成分減少，也可產生耐藥，但多烯類臨床應用30多年來，耐藥的仍較少見［27］。

2.2 唑類抗念珠菌藥

2.2.1 藥物作用靶位改變

與細胞色素 P450 相關的 C－14－α2－去甲基化酶(P450－14DM)是唑類藥物的靶向酶。該靶向酶是念珠菌細胞膜成分麥角固醇合成的必需酶，唑類藥物對其具有很強的親和力，從而抑制酶的催化活性，使得麥角固醇合成受阻，細胞膜結構破壞，念珠菌生長受抑制。靶向酶結構改變以及靶向酶過度表達均可導致念珠菌耐藥［28－29］。

2.2.2 胞內藥物累積減少

藥物在真菌細胞內聚集的減少是真菌產生耐藥性的一個重要機制。一是因為膜通透性降低使進入的藥物減少;二是細胞內的藥物外排增強。具有藥物外排功能的膜蛋白，作為一類鑲嵌在細胞膜上的蛋白，在抗真菌藥的作用下可被誘導表達，將細胞內的多種藥物等轉運到細胞外使細胞呈現耐藥性，這類膜蛋因此被稱之為多藥耐藥蛋白(multi－drug resistant associate protein，MRP)。在白色念珠菌中與耐藥有關的MRP主要分為兩大類:ABC轉運蛋白超家族－ATP結合盒轉運蛋白 (ATP binding cassette transporters，BCT)和易化擴散載體超家族(major facilitator superfamily，MFS)［30－31］。

2.2.3 生物合成途徑的改變

唑類藥物通過抑制P450－14DM的活性，使得羊毛甾醇不能轉換為14－α2－去甲基羊毛甾醇。后者在erg3基因編碼的△5，6脂肪酸脫氫酶催化下生成14－α2－3，2－二醇從而阻斷麥角甾醇的合成，并使甲基化固醇在真菌胞質內積蓄，從而抑制了細胞的生長。部分真菌由于erg3基因的突變，不能產生有活性的△5，6脂肪酸脫氫酶，致使在細胞內累積的是14－α2－甲基類固醇而不是 14－α2 甲基－3，2－二醇，而 14－α2－甲基類固醇能部分替代麥角甾醇的功能，持真菌細胞生長，從而對唑類耐藥［32－33］。

2.3 嘧啶類抗念珠菌藥:5-氟胞嘧啶

念珠菌對5－氟胞嘧啶產生耐藥性的主要機制是藥物的吸收降低或是由于基因突變導致胞嘧啶脫氨酶或尿嘧啶磷酸核糖基轉移酶缺乏，使5－氟胞嘧啶不能轉化為5－氟鳥苷酸，故而不能干擾真菌DNA的合成。已有研究［34－35］表明5－氟胞嘧啶的耐藥機制產生可能與fcy2、fcy1和fur1基因突變相關，而 Papon N等［36］所作的關于fcy2和fcy1的研究提示，這兩種基因的突變除了導致念珠菌對5－氟胞嘧啶耐藥，還會引起氟康唑的交叉耐藥。

2.4 棘白菌素類抗念珠菌藥

目前念珠菌對棘白菌素類藥物耐藥的報道極少。僅有部分國外研究［37－38］表明棘白菌素類藥物的靶基因fks1在Ser645位點的點突變會導致體外藥物敏感性試驗中部分念珠菌對棘白菌素類藥物產生耐藥，進而導致臨床治療失敗。

2.5 生物被膜的形成與耐藥

生物被膜是指真菌細胞通過分泌一些胞外的多糖蛋白質復合物，將自身包裹其中而在表面形成的膜狀物。真菌可借此天然屏障抵御抗生素從而產生持續性感染。研究［39－40］顯示，一些內置醫療材料如植入牙體、人工心臟瓣膜、中央靜脈導管、尿道插管等易引起念珠菌病，正是由于這些內置材料可作為念珠菌生物被膜形成的基質。生物被膜內真菌常表現出高度的耐藥性。其耐藥機制可能與下列因素有關:① 膜內真菌代謝率較低，生長速率減慢;②胞外聚合物基質所形成的膜屏障作用［41－42］;③ 表面誘導性耐藥基因的表達［43］。

3 臨床治療選藥推薦

美國感染性疾病學會(Infectious Diseases Society of America，IDSA)專家組在2009年制定了新的念珠菌病診療指南［44］，該版指南主要針對侵襲性念珠菌病和黏膜念珠菌病，并于2009年發表在Clinical Infectious Diseases雜志上用于替換該刊2004年發表的版本。該指南以指導醫師對該類患者或有感染此類疾病風險的人群進行治療或預防，故被醫務工作者廣泛地應用于臨床實際工作中。

3.1 念珠菌血癥的治療推薦

3.1.1 無中性粒細胞缺乏者

對多數成人患者的初始治療，推薦氟康唑或棘白菌素類。對中重度感染或近期有唑類藥物暴露史的患者，推薦棘白菌素類;對輕中度感染且近期無唑類藥物暴露史患者，推薦氟康唑。兒童方案與成人相同(調整劑量)。

若培養結果為對唑類敏感的念珠菌(如白念珠菌)且患者病情穩定，可用氟康唑替代棘白菌素類。

對光滑念珠菌感染，推薦棘白菌素類。若無藥物敏感性試驗證實，不推薦用氟康唑或伏立康唑。對初始治療采用氟康唑或伏立康唑的患者，若臨床癥狀改善，復查血培養陰性，可繼續用唑類藥物完成療程。

對近平滑念珠菌感染，推薦用氟康唑。對初始治療采用棘白菌素類的患者，若臨床癥狀改善，復查血培養陰性，可繼續用此類藥物完成療程。

若患者不耐受或得不到上述藥物，可用兩性霉素B或其脂質體。若培養結果為對唑類敏感的念珠菌(如白念珠菌)且患者病情穩定，可用氟康唑替代兩性霉素B或其脂質體。

伏立康唑對念珠菌血癥有效，但不優于氟康唑。僅對克柔念珠菌或伏立康唑敏感光滑念珠菌感染患者，才選用伏立康唑作為口服維持治療。

對無明顯合并癥的念珠菌血癥患者，療程為血培養陰性且臨床癥狀明顯緩解后維持2周。

強烈推薦拔除中央靜脈插管。

3.1.2 中性粒細胞缺乏者

對多數患者推薦棘白菌素類。

對輕中度感染且近期無唑類藥物暴露史的患者，可選用氟康唑。

對光滑念珠菌感染，推薦用棘白菌素類。脂質體兩性霉素B同樣有效，但價格較高并有潛在毒性。對已采用伏立康唑或氟康唑的患者，若臨床癥狀改善，復查血培養陰性，可用唑類藥物完成療程。

對近平滑念珠菌感染，推薦初始治療用氟康唑或脂質體兩性霉素B。對已采用棘白菌素類的患者，若臨床狀況穩定，復查血培養陰性，可用該類藥物完成療程。對克柔念珠菌感染，可選用棘白菌素類、脂質體兩性霉素B或伏立康唑。

對無明顯合并癥的念珠菌血癥患者，療程為血培養陰性且臨床癥狀明顯緩解、粒細胞缺乏緩解后維持2周。

推薦將中央靜脈插管拔除。

3.2 可疑侵襲性念珠菌病經驗性治療方案

3.2.1 無中性粒細胞缺乏者

經驗性治療與確診治療相同。初始治療推薦氟康唑或棘白菌素類。對中重度感染、或近期有唑類藥物暴露史、或光滑念珠菌/克柔念珠菌感染患者，推薦用棘白菌素類藥物。

若患者不耐受或得不到上述藥物，可用兩性霉素B或其脂質體。

經驗性治療應只針對存在侵襲性念珠菌病危險因素、伴無已知原因所致發熱的重癥患者，且應基于對危險因素的臨床評價、侵襲性念珠菌病血清學標志物和(或)非無菌部位的培養結果。

3.2.2 中性粒細胞缺乏者

推薦脂質體兩性霉素、卡泊芬凈或伏立康唑。

氟康唑和伊曲康唑可作為替代。

還可選擇兩性霉素B，但毒性較大。

若唑類藥物曾被用于預防性治療，則不宜用于經驗性治療。

3.3 念珠菌病高危者的預防性治療

對肝、胰腺和小腸移植患者，推薦在術后預防性選用氟康唑或脂質體兩性霉素B，至少用7～14 d。

對重癥監護患者，推薦預防性應用氟康唑。

對化學治療導致粒細胞缺乏患者，在化療后粒細胞缺乏期推薦預防性使用氟康唑、泊沙康唑或卡泊芬凈?？诜燎颠蛞部勺魈娲?，但患者耐受性較差。對接受干細胞移植的患者，在粒細胞缺乏期推薦預防性使用氟康唑、泊沙康唑或米卡芬凈。

3.4 氣道分泌物分離出念珠菌的意義

氣道分泌物有念珠菌生長很少提示侵襲性念珠菌病，因此對此類患者不應行抗真菌治療。大量前瞻性和回顧性研究包括尸檢均表明，對于侵襲性念珠菌病，呼吸道分泌物(包括支氣管肺泡灌洗液)培養有念珠菌生長的預測價值極低，不應作為開始抗真菌治療的依據。

［1］Kontoyiannis D P，Marr K A，Park B J，et al.Prospective surveillance for invasive fungal infections in hematopoietic stem cell transplant recipients，2001－2006:overview of the Transplant－Associated Infection Surveillance Network(TRANSNET)Database［J］.Clin Infect Dis，2010，50(8):1091－1100.

［2］Pfaller M A，Diekema D J.Epidemiology of invasive mycoses in North America［J］.Crit Rev Microbiol，2010，36(1):1－53.

［3］Pfaller M A，Diekema D J.Epidemiology of invasive candidiasis:a persistent public health problem［J］.Clin Microbiol Rev，2007，20(1):133－163.

［4］Pfaller M A，Diekema D J，Gibbs D L，et al.Results from the ARTEMIS DISK Global Antifungal Surveillance Study，1997 to 2007:a 10.5－year analysis of susceptibilities of Candida Species to fluconazole and voriconazole as determined by CLSI standardized disk diffusion［J］.J Clin Microbiol，2010，48(4):1366－1377.

［5］Slisz M，Cybulska B，Grzybowska J，et al.The mechanism of overcoming multidrug resistance(MDR)of fungi by amphotericin B and its derivatives［J］.J Antibiot(Tokyo)，2007，60(7):436－446.

［6］Agarwal R，Singh N.Amphotericin B is still the drug of choice for invasive aspergillosis［J］.Am J Respir Crit Care Med，2006，174(1):102.

［7］Heimark L，Shipkova P，Greene J，et al.Mechanism of azole antifungal activity as determined by liquid chromatographic/mass spectrometric monitoring of ergosterol biosynthesis［J］.J Mass Spectrom，2002，37(3):265－269.

［8］Charlier C，Hart E，Lefort A，et al.Fluconazole for the management of invasive candidiasis:where do we stand after 15 years?［J］.J Antimicrob Chemother，2006，57(3):384－410.

［9］Guinea J，Peláez T，Rodriguez－Créixems M，et al.Empirical treatment of candidemia in intensive care units:fluconazole or broad－spectrum antifungal agents?［J］.Med Mycol，2009，47(5):515－520.

［10］Schwarz P，Janbon G，Dromer F，et al.Combination of amphotericin B with flucytosine is active in vitro against flucytosine－resistant isolates of Cryptococcus neoformans［J］.Antimicrob Agents Chemother，2007，51(1):383－385.

［11］Dromer F，Bernede－Bauduin C，Guillemot D，et al.Major role for amphotericin B－flucytosine combination in severe cryptococcosis［J］.PLoS One，2008，3(8):e2870.

［12］Hope W W，Warn P A，Sharp A，et al.Surface response modeling to examine the combination of amphotericin B deoxycholate and 5－fluorocytosine for treatment of invasive candidiasis［J］.J Infect Dis，2005，192(4):673－680.

［13］Perlin D S.Current perspectives on echinocandin class drugs［J］.Future Microbiol，2011，6(4):441－457.

［14］Clinical and Laboratory Standards Institute.CLSI document M27－S3.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts;approved standard－third edition［S］.Wayne:CLSI，2008.

［15］Clinical and Laboratory Standards Institute.CLSI document M27－S3.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts;informational supplement［S］.Wayne:CLSI，2008.

［16］Guinea J，Sanchez－Somolinos M，Cuevas O，et al.Fluconazole resistance mechanisms in Candida krusei:the contribution of efflux－pumps［J］.Med Mycol，2006，44(6):575－578.

［17］Claudino A L，Peixoto R F，Jr，Melhem M S，et al.Correlation between CLSI，EUCAST and Etest methodologies for amphotericin B and fluconazole antifungal susceptibility testing of Candida spp.clinical isolates［J］.Pharmazie，2008，63(4):286－289.

［18］Pfaller M A，Castanheira M，Diekema D J，et al.Comparison of European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing(EUCAST)and Etest methods with the CLSI broth microdilution method for echinocandin susceptibility testing of Candida species［J］.J Clin Microbiol，2010，48(5):1592－1599.

［19］Espinel－Ingroff A，Barchiesi F，Cuenca－Estrella M，et al.International and multicenter comparison of EUCAST and CLSI M27－A2 broth microdilution methods for testing susceptibilities of Candida spp.to fluconazole，itraconazole，posaconazole，and voriconazole［J］.J Clin Microbiol，2005，43(8):3884－3889.

［20］Pfaller M A，Boyken L，Messer S A，et al.Evaluation of the etest method using Mueller－Hinton agar with glucose and methylene blue for determining amphotericin B MICs for 4，936 clinical isolates of Candida species［J］.J Clin Microbiol，2004，42(11):4977－4979.

［21］Ozcan S K，Mutlu B，Dundar D，et al.Comparison of broth microdilution and E－test methods for the antifungal susceptibility testing of Candida spp.strains isolated from blood cultures［J］.Mikrobiyol Bul，2010，44(2):263－271.

［22］Eraso E，Ruesga M，Villar－Vidal M，et al.Comparative evaluation of ATB Fungus 2 and Sensititre Yeast One panels for testing in vitro Candida antifungal susceptibility［J］.Rev Iberoam Micol，2008，25(1):3－6.

［23］Lopez J，Dalle F，Mantelin P，et al.Rapid identification of Candida glabrata based on trehalose and sucrose assimilation using Rosco diagnostic tablets［J］.J Clin Microbiol，2001，39(3):1172－1174.

［24］Pfaller M A，Moet G J，Messer S A，et al.Geographic variations in species distribution and echinocandin and azole antifungal resistance rates among Candida bloodstream infection isolates:report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program(2008 to 2009)［J］.J Clin Microbiol，2011，49(1):396－399.

［25］Mishra N N，Prasad T，Sharma N，et al.Pathogenicity and drug resistance in Candida albicans and other yeast species.A review［J］.Acta Microbiol Immunol Hung，2007，54(3):201－235.

［26］Perea S，Patterson T F.Antifungal resistance in pathogenic fungi［J］.Clin Infect Dis，2002，35(9):1073－1080.

［27］Ellis D.Amphotericin B:spectrum and resistance［J］.J Antimicrob Chemother，2002，49(Suppl 1):7－10.

［28］Asai K，Tsuchimori N，Okonogi K，et al.Formation of azole－resistant Candida albicans by mutation of sterol 14－demethylase P450［J］.Antimicrob Agents Chemother，1999，43(5):1163－1169.

［29］Kakeya H，Miyazaki T，Miyazaki Y，et al.Azole resistance in Candida spp［J］.Nihon Ishinkin Gakkai Zasshi，2003，44(2):87－92.

［30］Looi C Y，D'Silva E C，Seow H F，et al.Increased expression and hotspot mutations of the multidrug efflux transporter，CDR1 in azole－resistant Candida albicans isolates from vaginitis patients［J］.FEMS Microbiol Lett，2005，249(2):283－289.

［31］Niimi K，Maki K，Ikeda F，et al.Overexpression of Candida albicans CDR1，CDR2，or MDR1 does not produce significant changes in echinocandin susceptibility［J］.Antimicrob Agents Chemother，2006，50(4):1148－1155.

［32］Martel C M，Parker J E，Bader O，et al.Identification and characterization of four azole－resistant erg3 mutants of Candida albicans［J］.Antimicrob Agents Chemother，2010，54(11):4527－4533.

［33］Brumfield K M，Moroney J V，Moore T S，et al.Functional characterization of the Chlamydomonas reinhardtii ERG3 ortholog，a gene involved in the biosynthesis of ergosterol［J］.PLoS One，2010，5(1):e8659.

［34］Edlind T D，Katiyar S K.Mutational analysis of flucytosine resistance in Candida glabrata［J］.Antimicrob Agents Chemother，2010，54(11):4733－4738.

［35］Florent M，No?l T，Ruprich－Robert G，et al.Nonsense and missense mutations in FCY2 and FCY1 genes are responsible for flucytosine resistance and flucytosine－fluconazole cross－resistance in clinical isolates of Candida lusitaniae［J］.Antimicrob Agents Chemother，2009，53(7):2982－2990.

［36］Papon N，No?l T，Florent M，et al.Molecular mechanism of flucytosine resistance in Candida lusitaniae:contribution of the FCY2，FCY1，and FUR1 genes to 5－fluorouracil and fluconazole cross－resistance［J］.Antimicrob Agents Chemother，2007，51(1):369－371.

［37］Ben－Ami R，Garcia－Effron G，Lewis R E，et al.Fitness and virulence costs of Candida albicans FKS1 hot spot mutations associated with echinocandin resistance［J］.J Infect Dis，2011，204(4):626－635.

［38］Slater J L，Howard S J，Sharp A，et al.Disseminated Candidiasis caused by Candida albicans with amino acid substitutions in Fks1 at position Ser645 cannot be successfully treated with micafungin［J］.Antimicrob Agents Chemother，2011，55(7):3075－3083.

［39］Chandra J，Kuhn D M，Mukherjee P K，et al.Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans:development，architecture，and drug resistance［J］.J Bacteriol，2001，183(18):5385－5394.

［40］Mukherjee P K，Chandra J.Candida biofilm resistance［J］.Drug Resist Updat，2004，7(4－5):301－309.

［41］Nett J E，Sanchez H，Cain M T，et al.Interface of Candida albicans biofilm matrix－associated drug resistance and cell wall integrity regulation［J］.Eukaryot Cell，2011，10(12):1660－1669.

［42］Mukherjee P K，Chandra J，Kuhn D M，et al.Mechanism of fluconazole resistance in Candida albicans biofilms:phase－specific role of efflux pumps and membrane sterols［J］.Infect Immun，2003，71(8):4333－4340.

［43］Yu L H，Wei X，Ma M，et al.Possible inhibitory molecular mechanism of farnesol on the development of fluconazole resistance in Candida albicans biofilm［J］.Antimicrob A－gents Chemother，2012，56(2):770－775.

［44］Pappas P G，Kauffman C A，Andes D，et al.Clinical practice guidelines for the management of candidiasis:2009 update by the Infectious Diseases Society of America［J］.Clin Infect Dis，2009，48(5):503－535.