Bβ448野生型及突變型纖維蛋白原穩定轉染細胞系的建立

林 媛 李積鳳 劉 杰 牛夢林 孫 然 王 軍 劉 巖 王 辰

(1.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院呼吸與危重癥醫學科，北京市呼吸和肺循環疾病重點實驗室，北京呼吸疾病研究所，北京 100020;2.首都醫科大學基礎醫學院生理學教研室，北京 100069;3.衛生部北京醫院，北京 100730;4.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院心外科，北京 100020)

纖維蛋白原(fibrinogen)由Aα、Bβ、γ三對多肽鏈組成，分別由3個獨立的基因編碼:FGA、FGB和FGG［1］。其中Bβ鏈的合成是整個分子合成的限速步驟［2］，且Bβ鏈基因多態性是導致個體間血漿纖維蛋白原水平差異的重要遺傳因素，同時也與心腦血管疾病存在密切的相關性。BβArg448Lys是纖維蛋白原較常見的基因多態性之一，相關研究表明BβArg448Lys與心肌梗死［3］、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(以下簡稱冠心病)［4］及中國香港人高血壓［5］的發病有關。BβArg448Lys的位置靠近以下3個重要區域:預測的β鏈聚合點、β鏈和α鏈羧基端結合的區域及β鏈的鈣離子結合部位，這3個區域在纖維蛋白聚合過程中起重要作用［6-7］，故推測此突變位點參與調節纖維蛋白聚合進而影響纖維蛋白凝塊的結構與功能。以往有關BβArg448Lys基因多態性的研究多集中于病例對照研究，但一個基因位點的突變能否真正影響整個纖維蛋白原分子的功能，需要進一步的功能學實驗證據。而功能學研究的重要步驟之一就是要構建纖維蛋白原穩定表達細胞系。為此本研究通過借助體外重組技術，探討了構建野生型(BβArg448)和突變型(BβLys448)纖維蛋白原穩定表達細胞系的方法，為探討BβArg448Lys所致纖維蛋白原的結構與功能異常奠定基礎，進而為其相關血栓性疾病的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、宿主菌、細胞

人纖維蛋白原Aα鏈全長cDNA、Bβ鏈全長cDNA、γ鏈全長 cDNA的表達載體 pRSV-FGA、pMLPFGB、pRSV-FGG均由美國北卡羅來納大學教堂山分校Susan T.Lord教授惠贈。宿主菌E.coli DH5α及CHO-K1細胞均為本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

脂質體(Lipofectamine 2000)購自 Invitrogen公司;G418購自北京欣經科生物科技有限公司;組氨醇(Histidinol)、RNA提取試劑TRIzol購自Sigma公司;DMEM-F12培養基、胎牛血清購自Gibco公司;AMV反轉錄酶、限制性內切酶Dpn I、Pfu Turbo DNA聚合酶、ExTaq DNA聚合酶、600 bp DNA marker購自TaKaRa公司;QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit購自Stratagene公司;質粒大量提取試劑盒購自天根生化科技有限公司;PCR引物均由Invitrogen公司合成;其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 定點突變構建人工突變體 BβLys448的表達載體pMLP-FGB(448A)

根據突變位點設計并合成一對互補引物，上游引物:5'-GGAAGGGGTCATGGTACTCAATGAAGAAGATGAGTATG-3';下游引物:5'-CATACTCATCTTCTTCATTGAGTACCATGACCCCTTCC-3'，以 pMLP-FGB(448G)為模板，按照QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit方法，PCR擴增人工突變體BβLys448的表達載體pMLP-FGB(448A)。PCR反應條件為:95℃預變性30 s，95℃變性30 s，55℃退火1 min，68℃延伸10 min，共12個循環。PCR產物經DpnI在37℃下酶切1 h，直接取1 μL酶切產物轉化入E.coli XL1-Blue感受態細胞，藍白斑篩選后挑白斑單菌落培養擴增，保存菌株，提取質粒并送Invitrogen公司測序鑒定。

1.2.2 建立穩定轉染細胞系

將CHO-K1細胞置于含10%胎牛血清，1×105U/L青霉素和0.1 g/L鏈霉素的DMEM-F12培養基(完全培養基)中，接種于直徑為100 mm的培養皿中，5%CO2培養箱37℃培養，待細胞融合至80% ～90%時，用于細胞轉染。

首先將正常CHO-K1細胞接種于24孔板，檢測G418的1周最小致死濃度，重復3次，確定細胞G418的1周最小致死濃度為600 mg/L。

8 μg DNA(4 μg pRSV-FGA+4 μg pRSV-FGG)及 16 μL脂質體分別溶于200 μL無血清培養基，混勻室溫靜置5 min，混合稀釋的DNA和脂質體，室溫靜置20 min，移去細胞培養皿內含血清的正常培養基，PBS清洗后替換為4.6 mL無血清培養基，將稀釋的DNA與脂質體的混合物加入培養皿中，輕輕混勻。5%CO2培養箱37℃培養4 h后將無血清培養基更換為10 mL完全培養基。24 h后將細胞1∶10稀釋接種于10個直徑為100 mm的培養皿中。24 h后更換培養液，加G418(600 mg/L)，每2 d換液1次，1周后改用200 mg/L的G418維持篩選，4周后抗性克隆初步形成。顯微鏡下挑出單個細胞集落于24孔板中，并對應標記，避免單克隆之間的污染，分別逐步擴大培養。每個單克隆細胞株分別做RT-PCR鑒定，檢測出同時顯示表達纖維蛋白原Aα鏈與γ鏈的單克隆細胞株，繼而擴大培養，維持G418(200 mg/L)選擇壓力，每3 d換液或傳代，即得到穩定表達纖維蛋白原Aα鏈與γ鏈的細胞株CHO-K1-Aα-γ。

同理，將 CHO-K1-Aα-γ細胞接種于24孔板，檢測組氨醇的1周最小致死濃度，重復3次，確定細胞組氨醇的1周最小致死濃度為300 mg/L。

按上述方法將 pMLP-FGB(448G)8 μg、pMLP-FGB(448A)8 μg分別轉染于 CHO-K1-Aα-γ 細胞，加組氨醇300 mg/L，G418 200 mg/L，每2 d換液1 次，1 周后改用組氨醇100 mg/L，G418 200 mg/L維持篩選，4周后同時抗組氨醇與G418的抗性克隆初步形成。在細胞密度達80%時，移至培養瓶中傳代擴增，維持組氨醇100 mg/L+G418 200 mg/L的選擇壓力，每3 d換液或傳代，從而培養穩定表達野生型(BβArg448)與突變型(BβLys448)纖維蛋白原的細胞系CHO-K1-fibrinogen(BβArg448)、CHO-K1-fibrinogen(BβLys448)。

1.2.3 RT-PCR鑒定穩定轉染細胞系

收集持續傳代的穩定表達野生型與突變型纖維蛋白原細胞株 CHO-K1-fibrinogen(BβArg448)、CHOK1-fibrinogen(BβLys448)和未轉染質粒的CHO-K1細胞，根據TRIzol一步法分別提取細胞總RNA，用全波長酶標儀和瓊脂糖電泳檢測RNA純度、濃度及完整性。采用TaKaRa試劑盒，以(Oligo)dT為引物，在AMV反轉錄酶作用下反轉錄生成cDNA，－20℃保存備用或立刻用于PCR。在20 μL反應體系中加入cDNA 模板 1 μL，10 × PCR 緩沖液 2.0 μL，dNTP(25 mmol/L)1.0 μL，上下游引物(10 μmol/L)各 0.8 μL，ExTaq DNA 多聚酶0.1 μL，H2O 補足至20 μL。反應條件如下:95℃預變性5 min，95℃ 30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環，72℃繼續延伸10 min，置4℃保溫。取等體積RT-PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳并進行紫外成像。

FGA上游引物:5'-ATCTGCCTGCAAAGATTCAGAC-3'，下游引物:5'-CCTACTGCATGACCCTCGAC-3';FGB上游引物:5'-ATCCCAACTAACCTTCGTGTG-3'，下游引物:5'-TCTTGACGGTTCTGAATCACT-3';FGG上游引物:5'-TCAAGACATTGCCAATAAGGGA-3'，下游引物:5'-GTCACTAGGATCATCGCCAA-3'。

2 結果

2.1 突變型BβLys448纖維蛋白原表達載體pMLPFGB(448A)質粒的鑒定

DNA測序結果(圖1)顯示FGB448位堿基序列已由原來編碼精氨酸(Arg)的AGG成功地突變為編碼賴氨酸(Lys)的AAG，且無其他基因的錯讀及錯配。表明成功構建了人工突變體pMLP-FGB(448A)。

圖1 野生型(A)與突變型(B)纖維蛋白原表達載體pMLP-FGB核苷酸序列比對Fig.1 Nucleotide blast of wild type(A)and mutant type(B)fibrinogen expression vector pMLP-FGB

2.2 穩定轉染細胞系的篩選

pRSV-FGA及pRSV-FGG轉染CHO-K1細胞，G418維持篩選后，抗 G418(圖2A)細胞克隆初步形成。RT-PCR鑒定篩選出同時表達纖維蛋白原Aα鏈與γ鏈的單克隆細胞株，繼而轉染pMLP-FGB(448G)/pMLP-FGB(448A)，G418與組氨醇維持篩選后，同時抗G418與組氨醇(圖2B、C)的細胞克隆初步形成。

2.3 穩定轉染細胞系 CHO-K1-Aα-γ、CHO-K1-fibrinogen(BβArg448)、CHO-K1-fibrinogen(BβLys448)鑒定結果

圖2 穩定轉染細胞系的篩選Fig.2 Screening of stably transfected cell clones

穩定轉染細胞系CHO-Aα-γRT-PCR結果顯示，可以擴增得到FGA 427 bp及FGG 445 bp的特異性條帶(圖 3)。穩定轉染細胞系 CHO-K1-fibrinogen(BβArg448)(野生型)、CHO-K1-fibrinogen(BβLys448)(突變型)RT-PCR結果顯示，可以擴增得到FGA 427 bp、FGB 290 bp及FGG 445 bp的特異性條帶(圖4、5)，且全部經測序確定。而在未轉染質粒的CHO細胞中，FGA、FGB、FGG均未有mRNA水平的表達，表示穩定轉染細胞系CHO-K1-Aα-γ、CHO-K1-fibrinogen(BβArg448)、CHO-K1-fibrinogen(BβLys448)在轉錄水平構建成功。

圖3 穩定轉染細胞(CHO-K1-Aα-γ)與未轉染質粒的CHO-K1細胞RT-PCR檢測結果Fig.3 RT-PCR results of stable transfected cells CHO-K1-Aα-γ and untransfected CHOK1 cells

圖4 野生型纖維蛋白原穩定轉染細胞CHOK1-fibrinogen(BβArg448)與未轉染質粒的CHO-K1細胞RT-PCR檢測結果Fig.4 RT-PCR results of stable transfected cells CHO-K1-fibrinogen(BβArg448)and untransfected CHO-K1 cells

圖5 突變型纖維蛋白原穩定轉染細胞CHOK1-fibrinogen(BβLys448)與未轉染質粒的CHO-K1細胞RT-PCR檢測結果Fig.5 RT-PCR results of stable transfected cells CHO-K1-fibrinogen(BβLys448)and untransfected CHO-K1 cells

3 討論

纖維蛋白原(fibrinogen)是一種相對分子質量為340 000的糖蛋白，由肝細胞合成并分泌。每一個纖維蛋白原分子由3對非等同的多肽鏈Aα，Bβ和γ組成［8］。纖維蛋白原作為凝血系統中含量最高的凝血因子，是凝血系統的主要成分，是整個凝血過程的底物［9］。

纖維蛋白原的基因多態性與多種疾病的發生相關［10-11］。BβArg448Lys是纖維蛋白原研究較多的基因多態性之一。Behague I等［4］通過血管造影術評估冠狀動脈疾病患者(CAD)時發現，三支血管病變的病人BβLys448等位基因頻率高于雙支、單支血管病變的CAD患者。Carter A M等［12］對305例急性腦卒中患者及197例健康對照進行的病例研究發現，BβArg448Lys位點基因型頻率及等位基因頻率在女性腦卒中患者組與女性健康對照組之間存在明顯差異，且不依賴于纖維蛋白原水平的變化，推測BβArg448Lys可能導致纖維蛋白原分子結構變化，進而改變纖維蛋白凝塊結構，形成更堅固或更不易被纖溶酶溶解的纖維蛋白凝塊。也有報道［13］表明，纖維蛋白凝塊的結構受基因因素影響，且多于三分之一由基因變異所致。但一項包含2組人群(一組為3 657名心肌梗死患者與1 211例正常對照組;另一組為1 392名正常心肌梗死患者與1 392名對照組)的大樣本病例對照研究證實，BβArg448Lys與心肌梗死沒有明顯相關性［14］。Theodoraki E V 等［15］也認為在希臘人中，BβArg448Lys基因多態性與CAD的發病危險性無相關性。關于BβArg448Lys對纖維蛋白原的結構影響報道不一，有研究［16］表明 BβLys448基因型血漿標本形成的凝塊結構較BβArg448基因型更緊密，有研究［17］則否認這一相關性。因此，纖維蛋白原BβArg448Lys基因多態性所致的纖維蛋白原功能學的改變待進一步深入研究，以豐富人類基因庫，為相關的疾病提供基礎資料，且亟待進一步用體外重組等方法探討其機制，為疾病的病因提出新的學說。

而要體外重組構建穩定轉染纖維蛋白原BβArg448Lys野生型及突變型細胞系，是研究纖維蛋白原BβArg448Lys基因多態性所致的纖維蛋白原功能學改變的關鍵步驟。為此，本研究采用兩步法構建野生型及突變型纖維蛋白原穩定轉染細胞系。本研究采用CHO-K1細胞作為轉染細胞是因為CHO-K1細胞是用于外源蛋白表達常見的哺乳動物細胞，具有外源蛋白質表達穩定，易于規模化培養等優點，且由于正常CHO-K1細胞株不表達纖維蛋白原，因此CHO-K1細胞是纖維蛋白原專一表達的合適宿主細胞。

本研究先將編碼纖維蛋白原Aα鏈及γ鏈的表達載體共轉染入CHO-K1細胞，二者為新霉素抗性，G418抗性克隆細胞經RT-PCR鑒定篩選獲得同時具有Aα鏈及γ鏈mRNA水平表達的穩定轉染細胞系。在此基礎上再分別轉染編碼野生型及突變型纖維蛋白原Bβ鏈的質粒(帶組氨醇篩選標簽)，同時抗G418及組氨醇的細胞克隆擴增培養并經RT-PCR鑒定同時具有纖維蛋白原Aα鏈、γ鏈、野生型/突變型Bβ鏈mRNA水平表達。此外考慮到目的基因可能由于同源重組置換了原有的轉基因，本實驗在無G418及組氨醇維持培養構建的纖維蛋白原穩定轉染細胞系3月后重復檢測，仍可檢測到Aα鏈、γ鏈、野生型/突變型Bβ鏈mRNA水平表達，表明外源性野生型/突變型人纖維蛋白原已穩定整合和表達。當然本轉染體系仍面臨一些問題，如啟動子之間有可能由于競爭或飽和作用造成目的基因的表達不均衡，但纖維蛋白原三條鏈的合成速率與表達量本身就不均衡［18］，且不影響重組纖維蛋白原的功能及純化。

綜上所述，本研究成功建立了在mRNA水平穩定表達野生型(BβArg448)和突變型(BβLys448)纖維蛋白原穩定轉染細胞系，為獨立考察纖維蛋白原BβArg448Lys基因多態性及與纖維蛋白凝塊的結構及功能的關系提供了理想的細胞模型，使直接對BβArg448Lys的功能學研究成為可能，為相關疾病的研究提供有用工具。

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