慢性丙型肝炎患者DNT細(xì)胞及T細(xì)胞亞群的研究

梁 騎 焦艷梅 計(jì)云霞 李 田 吳 昊 張國(guó)元 唐 中*

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，南充 637100;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院感染科，北京 100069)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)慢性感染是全球范圍的重要公共衛(wèi)生問題之一，全世界感染者已超過一億七千萬。由于血制品的廣泛應(yīng)用，器官移植的興起及不良生活方式的蔓延等因素。我國(guó)的慢性HCV感染人數(shù)呈顯著上升趨勢(shì)。慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)由于其肝硬化和肝癌的發(fā)生率明顯高于慢性乙型肝炎，嚴(yán)重危害了人類的身體健康，而備受重視和關(guān)注［1］。近年來HCV感染慢性化的機(jī)制尤其是宿主的免疫因素成為研究的熱點(diǎn)。CD3+CD4－CD8－(double negative T，DNT)細(xì)胞是近年來新發(fā)現(xiàn)的一群免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，在正常人的外周血約占總淋巴細(xì)胞的1% ～5%，該DNT細(xì)胞表達(dá)Fas/FasL、TNF/TNFR，CD3+、CD4－、CD8－、MHC Ⅰ等［2］。DNT細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)、免疫抑制、自身免疫及抗腫瘤方面具有非常重要的作用［2-5］。國(guó)內(nèi)外未見慢性HCV感染者中DNT細(xì)胞文獻(xiàn)的報(bào)道，為了解HCV感染者機(jī)體免疫狀態(tài)、免疫功能情況，探討細(xì)胞免疫在HCV感染者發(fā)病過程中的作用，本課題組用流式細(xì)胞儀對(duì)92例慢性HCV感染者的DNT細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行了檢測(cè)分析，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究標(biāo)本來源于2010年6月至2011年6月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院感染科門診及住院患者，92例(男47例，女45例)慢性HCV感染患者年齡(28～66)歲，平均年齡(40±13)歲。另選首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院健康體檢者93例(男49例，女44例)，年齡(24～62)歲，平均年齡(32±9)歲，兩組患者性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。病例選擇標(biāo)準(zhǔn)參考2004年丙型肝炎防治指南［6］:血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)反復(fù)升高，病程超過6個(gè)月;血清HCV RNA(RT-PCR法)和(或)抗HCV(ELISA法)陽性;排除其他病毒感染，包括甲型、乙型、戊型肝炎病毒和巨細(xì)胞病毒、EB病毒感染;排除自身免疫性肝炎、乙醇性肝病和代謝性肝病;近3個(gè)月內(nèi)未使用抗病毒藥物及免疫抑制劑。

1.2 方法

1.2.1 試劑

改良型RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone公司)、聚蔗糖-泛影葡胺分層液(淋巴細(xì)胞分離液，F(xiàn)icoll，天津)，流式抗體:CD3-PerCP/CD4-FITC/CD8-PE三標(biāo)記單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2.2 儀器

流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司生產(chǎn)的FACSCantotmⅡ型。

1.2.3 方法

取HCV感染者及健康者外周靜脈血1 mL，EDTA-K2抗凝。于每支試管中加入10 μL的三標(biāo)記單克隆抗體 CD3-PerCP/CD4-FITC/CD8-PE，再加入50 μL抗凝靜脈血，充分混勻，25℃避光孵育20 min后，加入紅細(xì)胞溶解液250 μL，充分溶解紅細(xì)胞20 min后，以1 200 r/min的速度離心5 min，去上清，PBS緩沖液沖洗2次，最后以500 μL的PBS緩沖液懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)10 000個(gè)淋巴細(xì)胞，各細(xì)胞亞群分別用百分比和絕對(duì)計(jì)數(shù)表示，百分比以T細(xì)胞的百分比表示，絕對(duì)計(jì)數(shù)則以細(xì)胞/mm3表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性HCV感染者DNT細(xì)胞分布

慢性 HCV感染者 DNT細(xì)胞比例(8.57% ±6.16%)高于正常對(duì)照組(6.78% ±4.50%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖1A)。慢性HCV感染者DNT細(xì)胞絕對(duì)數(shù)(102.82±85.19)/mm3和正常對(duì)照組(118.84±84.83)/mm3相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)(圖1B)。慢性HCV感染者DNT細(xì)胞流式散點(diǎn)圖見圖2A、B，正常健康對(duì)照組DNT細(xì)胞流式散點(diǎn)圖見圖2C、D。

圖1 慢性HCV感染者和正常對(duì)照組DNT細(xì)胞分布情況Fig.1 The distribution of DNT cells between chronic HCV infection and normal control group

2.2 T細(xì)胞亞群分布

慢性HCV感染者CD3+CD4－CD8+比例高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，慢性HCV感染者CD3+CD4+CD8－比例、CD4+/CD8+比值均低于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，詳見表1。

圖2 CD3+CD4－CD8－(DNT)細(xì)胞流式散點(diǎn)圖Fig.2 The flow cytometric dot plots of CD3+CD4－CD8－(DNT)cell

表1 慢性HCV感染者和健康對(duì)照組T細(xì)胞亞群分布Tab.1 The distribution of T lymphocyte subsets between chronic HCV infection and normal control group

3 討論

最近的研究［2，4］表明，人類的 DNT 細(xì)胞具有免疫抑制功能，是一種新的免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞，通過清除同種同源性的CD8+T細(xì)胞和產(chǎn)生IL-4和IL-10等途徑對(duì)機(jī)體起抑制性免疫調(diào)節(jié)作用。從轉(zhuǎn)基因小鼠中純化出的DNT細(xì)胞可直接清除同種同源性的CD8+T細(xì)胞，從普通B57BL/6小鼠、fas基因突變的Ipr小鼠和fasl基因突變的gld小鼠中分離出的DNT細(xì)胞，可殺傷已被激活的同種同源性的 CD8+T細(xì)胞［2，7］;體外的研究［7］亦表明，人類DNT細(xì)胞在體外被激活后可產(chǎn)生IL-4和IL-10，對(duì)機(jī)體起抑制性免疫調(diào)節(jié)作用。

本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示慢性HCV感染者DNT細(xì)胞比例明顯高于正常對(duì)照組，提示DNT細(xì)胞的異常表達(dá)可能參與了慢性HCV疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，推測(cè)其可能通過抑制輔助性T細(xì)胞，使機(jī)體免疫功能降低，導(dǎo)致病情的加重或病毒持續(xù)感染，使HCV感染慢性化。另一原因可能是感染HCV后，CD4+細(xì)胞急劇減少，DNT細(xì)胞加速增生補(bǔ)償 CD4+有關(guān)，但對(duì)慢性HCV感染者DNT細(xì)胞確切的作用及機(jī)制目前還不明確，有待于進(jìn)一步研究。

在HCV的病理生理中，宿主的免疫狀態(tài)是決定病情發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。機(jī)體維持正常的免疫功能狀態(tài)，有賴于T淋巴細(xì)胞及其亞群之間的相互協(xié)調(diào)或制約，如果這些細(xì)胞的功能和數(shù)量發(fā)生變化，則可視為免疫功能紊亂，這些均與疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示慢性HCV感染者CD3+CD4－CD8+(殺傷性 T細(xì)胞)比例高于健康對(duì)照組，而 CD3+CD4+CD8－(輔助性 T細(xì)胞)比例、CD4+/CD8+比值均低于健康對(duì)照組，這和劉毓剛等［9］報(bào)道一致。HCV感染后引起T細(xì)胞亞群的這種變化，可能是HCV感染慢性化的重要原因之一，迄今為止，HCV的致病機(jī)制仍不很清楚，目前不少學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞免疫可能是HCV發(fā)病的主要機(jī)制［10-11］。其主要依據(jù)是:①丙型肝炎肝組織特征性的病理改變之一為匯管區(qū)淋巴細(xì)胞聚集或形成濾泡，甚至出現(xiàn)生發(fā)中心。② HCV感染的肝細(xì)胞周圍有許多的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，有的被感染細(xì)胞還和淋巴細(xì)胞連在一起。③ CHC患者HCV致敏的CD8+T細(xì)胞能溶解自身的肝細(xì)胞，具有抗原特異性的CD4+T細(xì)胞在清除HCV及致病過程中發(fā)揮著重要作用。兩者比例發(fā)生變化后有可能導(dǎo)致兩種細(xì)胞不能很好地協(xié)調(diào)作用，從而影響了機(jī)體清除HCV的能力，導(dǎo)致HCV感染的持續(xù)。

綜上所述，CHC患者DNT細(xì)胞百分比顯著升高及T淋巴細(xì)胞亞群比例改變，可能是導(dǎo)致HCV感染慢性化的重要原因之一。

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