妊娠晚期維生素C干預對大鼠先天性膈疝模型中胎肺的作用

蔡晶晶 陳永衛 張建敏*

(1.首都醫科大學附屬北京兒童醫院麻醉科，北京 100045;2.首都醫科大學附屬北京兒童醫院外科，北京 100045)

先天性膈疝(congenital diaphragmatic hernia，CDH)是由于膈肌發育缺損或發育不全，腹腔臟器經過這些缺損進入胸腔的一種疾病，不僅造成同側肺臟發育不良，同時也引起對側肺臟的發育和功能異常，活產患兒中發病率約為 1∶2 000－3 000［1］。對于一些出生后已存在嚴重肺臟發育不良的患兒，手術治療仍很難存活。因此，有關研究人員希望拓寬該病的治療方向，通過產前干預促進肺臟發育［2］，為臨床治療提供新的思路。

目前，這一新思路的研究還集中在動物實驗階段。此前已有一些研究［3］顯示，先天性膈疝的肺臟發育不良與細胞內的氧化反應有關，因此本研究通過建立先天性膈疝模型，應用具有抗氧化性質的維生素C作為產前干預藥物，研究其對胎鼠肺臟發育的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

1)孕鼠:S－D雌鼠12只〔生產許可證號:SCXK(京)2005－0006，使用許可證號:SYXK(京)2005－0022〕，體質量250 g左右，初次妊娠，采用抽簽法隨機分為對照組(C)、維生素C組(W)膈疝組(N)及治療組(T)。

2)胎鼠:正常孕期為22 d，孕21 d時相同麻醉方法下剖腹取出胎鼠(對照組29只，維生素C組26只，膈疝組32只，治療組30只)。

3)肺臟標本:取出稱質量后立即投入Bouin液中固定。

1.2 實驗方法

1)體質量250 g左右的S－D雌鼠，夜間合籠交配，次日晨檢查，以見到孕栓記為妊娠第0天。

2)妊娠9.5 d時，對照組及維生素C組予1 mL食用油灌胃;膈疝組及治療組予100 mg除草醚(NITROFEN——2，4－二 氯 苯 基－P－硝 基 苯 醚，Sigma 公司);溶于1 mL食用油中灌胃。

3)妊娠16.5～20.5 d時，對照組及膈疝組每日腹腔注射1 mL 0.9%氯化鈉注射液，連續5 d;維生素C組及治療組每日腹腔注射1.5 mg維生素C(溶于1 mL 0.9%氯化鈉注射液中)，連續5 d。

4)為避免同類相食，于孕21 d時水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉孕鼠，剖腹取出胎鼠，分別記錄3組胎鼠的體質量，檢查各組胎鼠的膈疝發生率、發生部位及膈肌缺損程度。將胎鼠的肺臟取出稱質量。

5)取出肺臟標本在Bouin液中固定24 h，制備石蠟切片，免疫組織化學技術顯示ki－67的表達。試劑盒購自中杉公司，烤片后脫蠟入水，滅活內源性過氧化物酶，抗原修復，標記一抗(經預實驗確定抗體稀釋濃度為1∶200)、二抗，DBS顯色，蘇木精復染，脫水透明，加拿大樹膠封片。細胞核顯棕黃色者為增生的陽性細胞。每組采用抽簽法隨機選取2張切片，每張切片計算機隨機選取6個高倍(×40)視野記錄圖像并保存(LEICAQWin，LEICA Q5501W，顯微鏡 DM LB2)。雙人雙盲法計算每個視野的陽性細胞比例。

1.3 統計學方法

采用SPSS 11.5統計軟件進行數據處理，計量數據用均數±標準差(±s)表示，行單因素方差分析及均數兩兩比較，計數數據用例數表示，行χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膈疝發生率

對照組及維生素C組胎鼠中無膈疝發生;膈疝組與治療組的膈疝發生率分別為53.13%和46.67%，兩組差異無統計學意義，詳見表1。

表1 膈疝發生情況Tab.1 Incidences of CDH (%)

2.2 胎鼠平均體質量

治療組胎鼠平均體質量高于另3組，結果差異有統計學意義，另3組組間差異無統計學意義(表2)。

2.3 平均胎肺質量

維生素C組及治療組的平均胎肺質量均高于對照組，對照組高于膈疝組，結果差異有統計學意義，詳見表2。

表2 各組胎鼠平均體質量、肺臟質量及增生細胞比例Tab.2 Mean body weight，lung weight and percentage of proliferation cells of fetal rat for each group

2.4 增生細胞比例

膈疝組增生細胞比例低于另3組，結果差異存在統計學意義，3組組間差異無統計學意義，詳見表2。

低倍視野(10×)下觀察4組胎鼠肺臟組織形態，細胞核顯棕黃色者為增生的陽性細胞(圖1)。

高倍視野(40×)下計算各組增生細胞比例，結果膈疝組增生細胞比例低于另3組(圖2)。

圖1 免疫組織化學技術顯示胎鼠肺組織ki-67的表達Fig.1 Immunohistochemical stain(Ki-67)of fetal lung(10×)

3 討論

Nitrofen最初曾被用作除草劑，又稱除草醚，在發現其有致膈疝畸形的作用后被淘汰。但這一發現卻為膈疝的研究者們所利用，作為建立膈疝模型的藥物。根據早期研究［4］，除草醚的致畸機制主要在于其化學結構與甲狀腺素(T4)極為相似，因此推斷除草醚可能是通過競爭T4受體，取代或部分取代母鼠和胎鼠T4的作用，從而導致肺臟等臟器發育不良。

雖然肺臟的發育不良與疝入臟器的機械壓迫有關，但動物CDH模型研究［5］顯示:某些與肺臟發育分化有關的蛋白因子、染色體以及基因的表達也出現異常。Beckman D L等［6］在研究中將暴露了除草醚但沒有發生CDH的標本也統計在內，結果發現即使在沒有CDH的情況下，肺功能也顯著降低;賈煒等［7］對除草醚誘導的大鼠CDH模型進行了研究，結論是:無論是否發生了CDH，肺泡面積與對照組相比均顯著減少，肺泡間隔也都顯著增厚。由此提出，存在原發肺臟發育不良的可能。所以在本次實驗中，將膈疝組及治療組中未發生膈肌缺損的數據也一并統計在內進行了分析，無論是肺臟質量還是細胞增生方面，所得到的結果與發生膈疝組基本相同，支持了上述肺臟存在原發發育不良的觀點。

現階段膈疝產前診斷的主要方法為B超，歐洲的產前診斷率達 59%，平均診斷時間為 24.2 周［8－9］，國內的診斷時間基本在孕晚期——所以，本次實驗將給藥時間確定為孕晚期，希望對臨床工作起到一定的幫助作用。

圖2 免疫組織化學技術顯示胎鼠肺組織ki-67的表達Fig.2 Immunohistochemical stain(Ki-67)of fetal lung(40×)

維生素C作為眾所周知的抗氧化劑，具有獲取方便、價格便宜等優勢，因此，本次實驗選取維生素C作為干預因素，實驗結果是孕晚期維生素C的干預沒有明顯改變胎鼠先天性膈疝的發生率。由于正常膈關閉的時間是孕17 d，膈肌缺損及臟器疝入有可能在此前已經發生，而本次實驗維生素C的干預時間為孕16.5～20.5 d，因此考慮給藥時間較晚可能是影響維生素C作用的原因之一。由于此前相似方法的研究結論較少，可用來比較的結果有限，維生素C對于膈疝發生率及胎肺發育的作用究竟如何還有待今后更多大樣本實驗的證實。

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