過表達apoA－Ⅰ對BEL－7402細胞內脂質堆積的影響

覃 嶺 王宇童

(首都醫科大學基礎醫學院細胞生物學系，肝臟保護與再生調節北京市重點實驗室，北京 100069)

肝臟是人體參與多種物質合成與代謝的重要器官，易受到如病毒、乙醇以及藥物等多種毒物的損害。目前非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)已成為全球肝病學家廣為關注的一種肝病。NASH以脂肪變性與脂肪肝為特征，并且越來越多的研究［1-3］表明其與胰島素耐受及代謝綜合征相關。NASH的病因尚未明了，目前比較認同的觀點是“二次打擊”學說。有研究［4］結果顯示，過多沉積于肝細胞的脂肪酸(free fatty acid，FFA)可能是誘發脂肪肝，造成NASH“第一次打擊”的元兇之一，同時，FFA所引發的脂質過氧化反應，產生的超氧離子及自由基損傷是造成肝細胞“第二次打擊”的重要原因。可見，FFA在NASH的發生發展過程中扮演著一個重要的角色。近期還有報道指出“第二次打擊”還與自然殺傷 T 細胞(natural killer T，NKT)缺陷［5］，T 細胞的調節異常［6］以及腸道微生物改變［7］有關。過量的脂質堆積在肝細胞是誘發肝炎發生的一個重要的因素［8］，因此，有效地將過量的脂質轉運出肝細胞是防治NASH的一個切入點。

ATP結合盒轉運子A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)可以將細胞內膽固醇和磷脂轉運到細胞外的apoA-Ⅰ上，從而促進高密度脂蛋白(high density-lipoprotein，HDL)的形成。在此過程中，載脂蛋白 A-Ⅰ(apolipoprotein A-Ⅰ，apoA-Ⅰ)是接受膽固醇和磷脂的關鍵蛋白，此過程也是高密度脂蛋白合成的限速步驟［9-10］。特異性的蛋白酶、不飽和脂肪酸、胞內膽固醇的細胞毒作用可以降解ABCA1蛋白，近期還有報道［11］提出，不飽和脂肪酸通過抑制ABCA1的表達會導致脂質在肝癌細胞HepG2中堆積，apoA-Ⅰ可以與 ABCA1 結合［12-13］，使 apoA-Ⅰ通過ABCA1上的PEST序列的磷酸化，抑制ABCA1鈣蛋白酶降解，從而增加ABCA1蛋白質水平，促進脂質外流［14-16］。故本課題旨在研究:在過表達apoA-Ⅰ的細胞模型中，是否可以通過其對ABCA1的穩定作用來減少不飽和脂肪酸對ABCA1的降解來減少脂質在肝癌細胞中的堆積，從而探索一種新方法，通過apoA-Ⅰ/ABCA1途徑改變細胞內脂質代謝來預防NASH的發生。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗室保存的BEL-7402細胞;Western blotting超敏發光液、游離脂肪酸超敏測定試劑盒、組織細胞總膽固醇酶法測定試劑盒、三酰甘油測定試劑盒、Hi-Gene轉染試劑(北京普利萊基因技術有限公司);噻唑藍(MTT)粉末(北京天來生物科技有限公司);glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)抗體(上海康辰生物有限公司);Plasmid Midi Kit(德國Qiagen 公司);pcDNA3.0 vector和 pcDNA3.0/apoA-Ⅰ(Invitrogen，Carlsbad，CA，美國);油紅 O(上海斯紅化工產品有限公司);蛋白酶抑制劑、棕櫚酸(palmitic acid，PA)、油酸(oleic acid，OA)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)(Sigma公司，美國);apoA-Ⅰ抗體(Cell Signaling Technology公司，美國)。

1.2 實驗方法

1)細胞培養及油紅染色

在35 mm細胞培養皿中加入蓋玻片，按4×105個細胞密度接種，用含10%的胎牛血清及1%的雙抗，培養20～24 h，待細胞匯合率達到80%，分別用200 μmol/L 和400 μmol/L 的飽和脂肪酸 PA、不飽和脂肪酸 OA及 PA/OA混合物(比例為 PA∶OA=1∶2)［17］加入培養基中作用于細胞 6、12 及 24 h 后。依次將玻片取出，放入新的孔板中，用室溫PBS沖洗3次，吸干多余水分，用10%中性甲醛固定細胞10 min，油紅O工作液染色10 min，蘇木精復染3 min，PBS沖洗10 min，50%甘油水溶液封片，顯微鏡下觀察，細胞內的脂質為紅色，細胞核為藍色。

2)質粒的制備

按照Qiagene Plasmid Midi Kit說明書操作。首先挑取單克隆pcDNA3.0空載體以及pcDNA3.0/apoA-Ⅰ菌落，制備100 mL相應菌液，通過離心使細菌沉淀;其次，依次加入試劑盒中的P1、P2和P3裂解細菌，離心取上清;再通過試劑盒中的柱子使帶負電的DNA黏附于柱子上，通過QBT以及QF將DNA洗滌、洗脫;最后用TE將pcDNA3.0空載體質粒以及pcDNA3.0/apoA-Ⅰ質粒溶解，測定DNA濃度。

按照HiGene轉染試劑說明書的方法采用d=35 mm的培養皿轉染真核細胞。①進行細胞懸液制備:用0.25%胰酶將細胞消化為單細胞懸液，按照4×105個細胞/皿準備細胞懸液備用;② 進行HiGene-DNA轉染混合物制備:分別將3 μg質粒pcDNA3.0空載體(對照組)和質粒 pcDNA3.0/apoA-Ⅰ(實驗組)稀釋于200 μL無菌0.9%氯化鈉注射液，振蕩混勻后，取7.2 μL HiGene加到 DNA溶液中，立即振蕩混勻，室溫靜置15 min后，全部加入到2 mL有血清無雙抗的DMEM中備用;將備好的HiGene-DNA轉染混合物加入到培養皿中后立即加入細胞懸液，實現鋪板的同時對細胞進行轉染。

4)測定細胞活力

將含有4×104個細胞的單細胞懸液100 μL分別接種于96孔板中，37℃、5%CO2培養細胞20～24 h后，分別更換含有200 μmol/L及400 μmol/L的不同脂肪酸的基礎培養基，37℃、5%CO2培養細胞6、12及24 h。按照時間要求，每孔加入50 μL MTT液(2 mg/mL)，37℃、5%CO2培養細胞繼續培養3 h，吸出孔內培養液后，每孔加入150 μL DMSO液，避光，振蕩10 min，使結晶物溶解。通過酶標儀，于490 nm波長處測各孔OD值。

5)蛋白定量及蛋白質印跡

在4℃條件下，加入裂解液提取人肝癌細胞系BEL-7402中的蛋白和細胞培養基中的蛋白。用BCA Protein Assay Kit測定樣品蛋白含量。每個樣本取50 μg蛋白進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉至PVDF膜上，用含5% 脫脂奶粉的TBST溶液封閉4 h，加入1∶1 000 apoA-Ⅰ人單克隆抗體于4℃ 孵育過夜。TBST漂洗2次，每次5 min，加入1∶5 000辣根過氧化物酶標記的鼠抗人IgG，室溫孵育1 h，TBST漂洗6次，每次5 min，GAPDH為內參，將膜用化學發光試劑孵育1 min，于X膠片上曝光，常規顯影、定影。將結果用Genetools軟件(Perkin Elmer)進行密度分析。

6)細胞內脂質的測定

分別按照三酰甘油酶法測定試劑盒、游離脂肪酸超敏測定試劑盒以及組織總膽固醇酶法測定試劑盒說明書中針對細胞測定的方法，采用d=35 mm細胞培養皿，分別按每106個細胞加0.1 mL相應裂解液的比例制備樣品，按照說明書操作，得到相應的OD值，后依標準曲線，分別得到細胞內三酰甘油、游離脂肪酸以及總膽固醇的濃度，結果以mmol/L表示。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件分析，組間比較采用單因素方差分析;以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 油紅O染色觀察NASH細胞模型中脂質的形態

油紅O染色結果表明，對照組BEL-7402細胞生長呈梭狀或扁平多邊形，胞質內無明顯紅染或淡染;模型組細胞中，尤其是用不飽和脂肪酸油酸(OA)及混合脂肪酸(PA:OA)作用的細胞質中廣泛染色呈紅色脂滴，大而多，而飽和脂肪酸棕櫚酸(PA)與不飽和脂肪酸及混合脂肪酸相比，形成的脂質明顯減少。另外，脂質形成隨脂肪酸濃度以及作用時間的增加而增加(圖1)。

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2.2 MTT法檢測不同脂肪酸對BEL-7402細胞活性的影響

采用200 μmol/L和400 μmol/L的不同脂肪酸處理BEL-7402細胞6、12和24 h后，MTT法測量細胞活性，結果顯示:飽和脂肪酸棕櫚酸的濃度越高，作用時間越長，對細胞活性的影響越大(圖2)。

2.3 Western blotting方法檢測apoA-Ⅰ的轉染

轉染了 pcDNA3.0/apoA-Ⅰ的細胞(實驗組)，通過與apoA-Ⅰ抗體作用，在28 000處出現明顯的條帶，而沒有轉染的pcDNA3.0空載體的細胞(對照組)，則不見條帶，說明apoA-Ⅰ轉染成功(圖3A)。轉染了 apoA-Ⅰ的培養基中有apoA-Ⅰ存在，而轉染空載體的細胞培養基中沒有 apoA-Ⅰ(圖 3B)。

2.4 apoA-Ⅰ對BEL-7402細胞內的脂質含量的影響

用200 μmol/L 濃度的 BSA、PA、OA、PA:OA 作用于正常細胞與轉染了apoA-Ⅰ的細胞24 h，分別測定細胞內三酰甘油、游離脂肪酸以及膽固醇的含量。結果顯示:與正常組(pcDNA3.0組)相比，過表達apoA-Ⅰ組(pcDNA3.0/apoA-Ⅰ組)細胞內各指標均減少。其中棕櫚酸處理后的細胞脂質減少程度弱(圖4)，可能與棕櫚酸本身在細胞內產生的脂質較少有關。

3 討論

載脂蛋白A-Ⅰ是ABCA1的主要脂質接受體，外周組織細胞內過量的脂質可以通過ABCA1/apoA-Ⅰ途徑，經膽固醇逆向轉運促進細胞內膽固醇和磷脂的流出。該部分理論的應用主要用于防治動脈粥樣硬化性心血管疾病，而在肝臟疾病領域應用的研究還比較少。本文主要探索ABCA1/apoA-Ⅰ途徑在非酒精性脂肪性肝炎中的作用。

NAFLD是肝臟排除乙醇及病毒引起的肝臟從單純脂肪變性發展到脂肪性肝炎、肝纖維化以及肝硬化的一系列病理綜合征。但是其發病原因并不明確，目前被肝病學家廣泛認同的機制是“二次打擊”學說。近年研究［18-20］證實，游離脂肪酸(free-fatty acid，FFA)能激活使肝臟內氧化應激亢進的轉錄因子NFκB，這正是同NASH發病中的第一、二次打擊均具相關性的重要因子。而它與肥胖、2型糖尿病以及高脂血癥，尤其是高三酰甘油血癥等代謝綜合征有著密切的關系。FFA、三酰甘油以及膽固醇是脂質的重要成分，因此，研究如何預防NASH的發生，可以從減少肝細胞內脂質的堆積入手。眾所周知，膽固醇和磷脂等脂質的轉運過程主要在肝臟完成。在膽固醇逆向轉運過程中，以apoA-Ⅰ為主的乏脂載脂蛋白可以將外周組織的膽固醇和磷脂轉運到肝臟，經過肝臟進一步的代謝，最終以膽汁酸或膽汁的方式排出［21］。

據以往研究［22］顯示，只有乏脂的apoA-Ⅰ結合于細胞膜上時，才能與ABCA1結合，并相互作用，轉運膽固醇及磷脂，生成HDL。因此，在本實驗中，過表達的apoA-Ⅰ只有釋放到細胞外，才可以與ABCA1相互作用，將細胞內過量的脂質轉運出細胞。這已在本實驗中通過 Western blotting實驗方法得到了驗證:apoA-Ⅰ確實釋放到細胞外。故該apoA-Ⅰ可以通過與細胞膜表面的ABCA1相互作用，行使其轉運細胞內膽固醇及磷脂的功能。

本實驗是通過用飽和、不飽和以及混合脂肪酸來構建含有脂質的BEL-7402細胞NASH模型，有相關研究［23］表明飽和脂肪酸棕櫚酸可以誘導人肝癌HepG2細胞凋亡，本實驗中使用的是人肝癌 BEL-7402細胞，棕櫚酸是否也會導致該細胞株的凋亡，以及什么樣的劑量以及作用時間導致其凋亡我們還不清楚，故本實驗分別用200 μmol/L和400 μmol/L的不同脂肪酸處理BEL-7402細胞6、12和24 h后，用MTT法測量細胞活性。原則上選擇最小劑量以及最短作用時間作為構建NASH細胞模型的實驗條件，因此本實驗選擇200 μmol/L濃度為最佳濃度，24 h為最佳作用時間。另外還有報道［24］指出，由不飽和脂肪酸衍生出來的含有雙鍵的二酰甘油可進一步激活蛋白激酶Cδ(PKCδ)，使ABCA1中絲氨酸的磷酸化水平增加，從而降低ABCA1蛋白穩定性，使蛋白降解速度加快。我們在前期研究［11］中發現，在人的肝癌細胞系HepG2細胞中，不飽和脂肪酸通過加快ABCA1的降解來抑制ABCA1蛋白質水平，ABCA1的表達直接影響到細胞內的FFA和三酰甘油的形成，同時在NASH大鼠肝臟中也看到ABCA1蛋白質水平的下降。而本文結果顯示，在BEL-7402細胞中，過表達apoA-Ⅰ后，由不飽和脂肪酸引起的細胞內脂質蓄積程度比對照組細胞明顯減輕。這與楊峻浩等［25］用apoA-Ⅰ處理單核巨噬細胞(human acute monocytic leukemia cell line，THP-1)源性泡沫細胞得到的結果一致。這些結果表明，apoA-Ⅰ與ABCA1相互作用一方面可以增強細胞ABCA1的脂質轉運功能，另一方面apoA-Ⅰ還可以通過和ABCA1結合，對ABCA1蛋白質起到穩定作用，從而提高細胞膜上ABCA1的蛋白質水平［26］。近期有實驗結果［27］顯示，apoA-Ⅰ可降低THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞內膽固醇聚積的機制可能是通過PKA信號途徑使細胞ABCA1蛋白質水平增加，而在本實驗中，apoA-Ⅰ在肝癌細胞內降低三酰甘油、游離脂肪酸以及膽固醇的聚積可能也是通過該途徑實現的。脂肪酸合成酶、乙酰輔酶A羧化酶等與脂質合成密切相關，有文獻［28］報道，氧甾酮作為LXR的配體，可調節這些重要酶的轉錄水平。因此我們還可以通過過量表達apoA-Ⅰ，從轉錄水平上，這些下調與脂質合成有關的酶的表達，從而降低細胞內脂質的堆積。更好地了解ABCA1/apoA-Ⅰ介導脂質轉運途徑及其調節機制，通過調控該途徑相關基因來防治NASH這一人類面臨的新的挑戰。

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