鹽脅迫富集發芽大豆γ-氨基丁酸的工藝優化

郭元新，楊潤強，陳 惠，宋 玉，顧振新,*

(1.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；2.安徽科技學院食品藥品學院，安徽 鳳陽 233100)

鹽脅迫富集發芽大豆γ-氨基丁酸的工藝優化

郭元新1,2，楊潤強1，陳 惠1，宋 玉1，顧振新1,*

(1.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；2.安徽科技學院食品藥品學院，安徽 鳳陽 233100)

在單因素試驗基礎上，應用響應面試驗研究氯化鈉濃度、培養時間和培養溫度對大豆發芽富集γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)的影響，目的是優化鹽脅迫條件下發芽大豆富集GABA的最佳培養條件。研究結果表明：豆芽在鹽脅迫條件下富集GABA的最優條件是氯化鈉濃度133.5mmol/L、培養時間5.5d、培養溫度33.3℃，在此條件預測的最高GABA富集量為1205.24μg/g。方差分析和驗證實驗顯示，模型可準確的預測鹽脅迫條件下大豆發芽過程中GABA的富集。

大豆；發芽；鹽脅迫；γ-氨基丁酸富集；響應面試驗

在中國及亞洲，發芽大豆作為人類的食物已有2000多年的歷史。作為一種健康和時尚產品，豆芽在歐洲各國飲食生活中的重要性與日俱增[1]。大豆(Glycine maxL.)是一種質優價廉的優質蛋白質、碳水化合物、維生素和礦物質來源。眾多研究表明，種子發芽過程中發生了大量復雜的生理生化變化[2-4]，種子中的酶不斷產生或被激活，一些大分子物質如淀粉和蛋白質被分解?？刂瓢l芽條件，還可生成和富集γ-氨基丁酸(γaminobutyric acid，GABA)等[3,5]大豆中原來含量低或不具有的功能成分。

GABA是一種以自由態廣泛存在于原核生物和真核生物中的四碳非蛋白質氨基酸。因為GABA具有降血壓，改善腦機能和緩解疼痛和焦慮等作用，富含GABA的食品近年來備受消費者歡迎[5-6]。已有的研究表明，植物中GABA的合成主要受GABA支路和多胺降解的影響，其中谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，GAD，EC 4.1.1.15)和二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO，EC 1.4.3.6)分別是這兩條途徑中的限速酶[7-8]。

植物在熱擊、冷害、鹽脅迫、機械刺激和低氧等脅迫條件下能夠強烈的激活GAD和DAO的酶活性，從而導致GABA的積累[7,9]，其中鹽脅迫是一種安全，環保的脅迫方式。盡管目前已有學者研究了不同發芽條件下[1,10-11]、CO2處理[12]、低氧脅迫[13]和谷氨酸鈉等條件[14]對大豆芽菜GABA富集的影響，但在發芽過程中應用鹽脅迫的方式促進豆芽GABA的富集，目前還沒有見到相關的報道。本研究利用響應面法優化鹽脅迫條件下發芽大豆富集GABA的最優工藝條件，為芽菜科學和大豆資源的開發利用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設備

Orion818型pH測試儀 美國Orion公司；1200型液相色譜儀 美國Agilent公司；TDL-40B型離心機 上海安亭科學儀器廠；DZF-6020型真空干燥器 上海一恒科技有限公司；PYX-DH-CBS型隔水電熱恒溫培養箱 上海躍進醫療器械廠；真空冷凍干燥系統 美國Labconce公司。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗

大豆種子用去離子水清洗后，用1%的次氯酸鈉溶液消毒15min，用去離子水沖洗至pH值中性，于去離子水中30℃浸泡4h。置于鋪有兩層濾紙的培養皿中，每8h噴氯化鈉溶液(脅迫處理)或去離子水(對照)一次，于生化培養箱中暗發芽，具體操作如下：(1)樣品分別置于20、25、30、35℃的培養箱內暗發芽，期間以100mmol/L氯化鈉溶液進行鹽脅迫處理；(2)樣品分別用0、50、10、150mmol/L的氯化鈉脅迫處理，發芽溫度30℃；(3)樣品用100mmol/L 氯化鈉溶液進行脅迫處理，分別培養0、1、2、3、4、5、6d后取樣測定其GABA含量。試驗結束后，所有樣品用去離子水清洗后用吸水紙吸干水分，液氮速凍后真空冷凍干燥，隨后粉碎至過8 0目篩，待測。

1.3.2 Box-Behnken設計

表1 大豆發芽富集GABA的培養條件響應面試驗因素及水平表Table 1 Factors and levels of RSM analysis

采用響應面試驗優化大豆發芽富集GABA的培養條件，每個處理重復3次。在單因素試驗的基礎上，選取氯化鈉濃度(X1)、培養時間(X2)和培養溫度(X3)作為研究對象(表1)，整個設計包括5個中心點共17個組合。以GABA含量(Y)作為響應值。優化結果將得出一個響應值(Y)與變量(Xi)間的二元多項回歸模型。

1.3.3 GABA含量的測定

唐玄奘，前世為如來二弟子金蟬子，法號“玄奘”，被尊稱為“三藏法師”，后世俗稱“唐僧”，受大唐皇帝之托組建取經四人組，從東土大唐出發，到西天拜佛求取真經。唐僧作為整個取經團隊的領袖，負責整個團隊的經營和管理，和車間主任的崗位較為相似。每天要掌控車輛的維修進度，協調車間的日常管理工作，對那些不聽話的人員不時還要念念“緊箍咒”。當然除了管理之外還要配合其他部門完成相應工作，關心自己團隊人員的工作與生活困難，遇到問題時還要幫忙解決?？偟膩碚f唐僧的工作比較繁瑣，需要由膽大心細、有責任心的人來做。

G A B A測定采用高壓液相色譜法，色譜柱為ZORBAX Eclipse AAA reversed-phase column(3.5μm)，4.6mm×150mm，條件參照Guo等[13]的方法。

1.3.4 統計分析

試驗設3次重復，結果以“x－±s”表示。響應面設計及分析采用Design Expert軟件(Version7.0.0，Stat-Ease Inc.，Minneapolis，MN，USA)，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫條件下發芽溫度對發芽大豆GABA富集的影響

圖1 鹽脅迫條件下溫度對發芽大豆GABA富集的影響Fig.1 Effect of temperature on GABA accumulation in germinated soybean under salt stress

如圖1所示，發芽至2d時，在35℃的培養溫度、鹽脅迫處理條件下豆芽中GABA含量(以干質量計，下同)達556.12μg/g，分別為30、25、20℃條件下的1.06、1.17、1.47倍；發芽至3d時，鹽脅迫處理組GABA含量則達765.13μg/g，分別為1.04、1.32、1.77倍，對照處理也呈現了相同的趨勢。另外，大豆發芽至2d時，20～35℃各溫度條件下，鹽脅迫組GABA含量分別是非脅迫組的1.25、1.15、1.14倍和1.09倍，發芽至3d時則達到1.22、1.34、1.37倍和1.19倍。可見，在20～35℃溫度范圍內，溫度越高越有利于豆芽積累GABA，各處理間差異極顯著(P＜0.01)，且鹽脅迫環境有利于GABA的富集。

2.2 氯化鈉濃度對發芽大豆GABA富集的影響

圖2 氯化鈉濃度對發芽大豆GABA富集的影響Fig.2 Effect of NaCl content on GABA accumulation in germinated soybean under salt stress

由圖2可見，在同一發芽時點上，不同的氯化鈉濃度對豆芽GABA的富集均有極顯著影響(P＜0.01)。濃度在0～100mmol/L變化時，豆芽中GABA含量升高，發芽5d后GABA含量達1121.8μg/g ，是對照(0mmol/L)處理的1.35倍，是原料的7倍(數據未顯示)。當氯化鈉濃度高于100mmol/L時，豆芽中GABA含量則呈下降的趨勢，然而發芽1d和3d時，100mmol/L和150mmol/L的氯化鈉處理間并未顯著差異(P＜0.05)。

2.3 鹽脅迫條件下發芽時間對發芽大豆GABA富集的影響

圖3 培養時間對發芽大豆GABA富集的影響Fig.3 Effects of culture time on GABA accumulation in germinated soybean

如圖3所示，培養時間對豆芽中GABA的富集具有極顯著影響(P＜0.01)。在鹽脅迫條件下，隨著培養時間的延長，豆芽中的GABA富集量逐步增長，在5d時達到最大值1145.5μg/g，是對照發芽5d后的1.40倍，是發芽前的4.4倍。發芽5d后，豆芽中GABA的富集有下降的趨勢。

2.4 Box-Behnken試驗模型的建立與方差分析

響應面設計和相應的試驗數據見表2。用多元統計分析結果顯示響應面的實驗結果符合二次回歸公式。描述GABA產量與各自變量關系的多項式公式如下：

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Box-Behnken design and experimental results for GABA content from germinated soybean

表3 回歸方程各項的方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) for the regression equation

統計分析結果(表3)顯示所建立的模型顯著，決定系數(R2)為0.9724，測定值與預測值之間有極高的擬合度。對回歸模型進行方差分析，F值為19.57，回歸模型極其顯著(P＜0.005)。模型的失擬性檢驗不顯著(P＞0.05)，說明二次模型相關性良好。比較模型的預測值和觀察值(圖4)，其預測方程的決定系數為0.9724，二者具有極顯著的相關性。模型的信噪比為12.036，其值遠大于4。所有的統計分析特征值表明，模型具有實踐指導意義。

圖4 預測值和觀察值之間的相關性Fig.4 Correlation between predicted and experimental results of GABA content

2.5 鹽脅迫條件下發芽大豆富集GABA的響應面分析及優化

為了確定發芽大豆富集GABA過程中各變量的最優水平和相互關系，利用回歸方程可以構建試驗因素之間的三維響應面圖，利用響應面曲線，可以很容易的分析因素之間的變化關系。

圖5 各兩因素交互作用對發芽大豆GABA含量影響的響應面及等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction among factors on GABA accumulation in germinated soybean

圖5a表示，在培養溫度30℃條件下，氯化鈉濃度和培養時間對GABA含量的影響。氯化鈉濃度的一次項(P＜0.005)和二次項(P＜0.005)極顯著影響GABA的含量，培養時間的一次項(P＜0.05)和二次項(P＜0.05)顯著的影響大豆芽菜中GABA的含量，但氯化鈉濃度和培養時間的交互作用不顯著(P＝0.1623)。在一定的氯化鈉濃度條件下，GABA含量隨著培養時間的延長增加，發芽5.5d時達到最高值。同樣，在一定培養時間條件下，GABA含量隨著氯化鈉濃度的增加呈現快速的增加，在發芽5.5d后GABA的富集達到最大值，隨后GABA含量緩慢下降。豆芽中GABA的富集受到氯化鈉脅迫的影響，這與其他研究得出的鹽脅迫使植物細胞胞內Ca2+濃度快速上升，從而誘導GAD活性上升[15]，同時，鹽脅迫還伴隨著多胺的減少和DAO活性的增加[7]，從而促進了植物中GABA的富集結果是一致的。

圖5b表示大豆芽菜培養5d后，氯化鈉濃度和培養溫度對發芽大豆富集GABA的影響。培養溫度的一次項(P＜0.05)和二次項(P＜0.005)顯著影響GABA的產量，但氯化鈉濃度和培養溫度的交互作用不顯著(P＞0.05)。在固定氯化鈉濃度的情況下，當培養溫度從25℃增加到33.3℃時，豆芽中GABA含量快速增加，繼續升高溫度時，GABA含量下降，說明33.3℃的的脅迫溫度有利于豆芽中GABA的富集。已有的研究表明，保持植物組織中GAD活性的最佳溫度為40℃[16]，較高的溫度有利于大豆芽菜中DAD酶活性的提高，導致GABA的富集，這與我們的研究結論是一致的。但大豆是適合生長在北方的耐寒性較強的作物，當溫度達到40℃時(數據未顯示)，豆芽的生長受到抑制，芽體變軟，最后會使豆芽萎縮直至死亡。

圖5c顯示了培養時間和溫度對發芽大豆GABA含量的影響。模型分析表明，二者的交互作用不顯著(P＞0.05)。在固定的培養溫度條件下，隨著培養時間的增加，GABA的含量上升，優化的培養時間為5.5d，這與固定氯化鈉濃度條件下培養時間的變化趨勢一致。在固定的培養時間條件下，隨著溫度的增加，GABA的含量上升，優化的培養溫度為33.3℃，和固定氯化鈉濃度條件下GABA隨培養溫度的變化相一致。

2.6 工藝條件優化及驗證實驗

根據響應面試驗結果，運用試驗模型得到發芽大豆富集GABA的最佳培養條件為氯化鈉濃度133.5mmol/L、培養時間5.5d、培養溫度33.3℃，在此條件下，GABA含量達到1197.36μg/g。

為考察模型的可靠性和準確性，隨機選擇最佳試驗組合和任一試驗組合進行驗證性實驗，驗證實驗的設計與結果列于表4。在優化的試驗條件下，發芽大豆中GABA的含量最高，達到1197.36μg/g，這與預測值的1205.24μg/g接近，任意組合試驗也顯示了同樣的預測性，驗證實驗結果進一步證明響應面模型優化試驗結果是可靠的。

表4 驗證實驗結果Table 4 Results of validation tests

3 結 論

在單因素試驗基礎上，采用響應面分析法優化鹽脅迫處理富集大豆芽菜GABA的培養條件。結果表明：氯化鈉濃度、培養時間、培養溫度對大豆芽菜GABA富集的影響極顯著，交互項均不顯著。鹽脅迫條件下大豆發芽富集GABA的最優條件為氯化鈉濃度133.5mmol/L、培養時間5.5d、培養溫度33.3℃，在此條件預測的最高GABA富集量為1025.24μg/g，而實際實驗測得的GABA富集量為1197.36μg/g，其相關系數極顯著(P＜0.01)。研究結果表明，大豆是生產富含GABA食品的優質原料，鹽脅迫可顯著提高豆芽中GABA的富集量。

[1] MARTINEZ-VILLALUENGA C, KUO Y H, LAMBEIN F, et al.Kinetics of free protein amino acids, free non-protein amino acids and trigonelline in soybean (Glycine maxL.) and lupin (Lupinus angustifoliusL.) sprouts[J]. European Food Research and Technology, 2006, 224(2):177-186.

[2] SIERRA I, VIDAL-VALVERDE C. Kinetics of free and glycosylated B-6 vitamers, thiamin and riboflavin during germination of pea seeds[J].Journal of the Science of Food and Agriculture, 1999, 79(2): 307-310.

[3] XU Maojun, DONG Jufang, ZHU Muyuan. Effects of germination conditions on ascorbic acid level and yield of soybean sprouts[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2005, 85(6): 943-947.

[4] BAU H M, VILLAUME C, NICOLAS J P, et al. Effect of germination on chemical composition, biochemical constituents and antinutritional factors of soya bean (Glycine max) seeds[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1997, 73(1): 1-9.

[5] VIDAL-VALVERDE C, FRIAS J, SIERRA I, et al. New functional legume foods by germination: effect on the nutritive value of beans,lentils and peas[J]. European Food Research and Technology, 2002, 215(6): 472-477.

[6] ABDOU A M, HIGASHIGUCHI S, HORIE K, et al. Relaxation and immunity enhancement effects ofγ-Aminobutyric acid (GABA) administration in humans[J]. Biofactors, 2006, 26(3): 201-208.

[7] SU Guoxing, YU Bingjun, ZHANG Wenhua, et al. Higher accumulation ofγ-aminobutyric acid induced by salt stress through stimulating the activity of diarnine oxidases inGlycine max(L.) Merr. roots[J]. Plant Physiology and Biochemistry. 2007, 45(8): 560-566.

[8] BOUCHE N, FROMM H. GABA in plants: just a metabolite?[J].Trends in Plant Science, 2004, 9(3): 110-115.

[9] BOUCHE N, LACOMBE B, FROMM H. GABA signaling: a conserved and ubiquitous mechanism[J]. Trends in Cell Biology, 2003, 13(12): 607-610.

[10] KUO Y H, ROZAN P, LAMBEIN F, et al. Effects of different germination conditions on the contents of free protein and non-protein amino acids of commercial legumes[J]. Food Chemistry, 2004, 86(4): 537-545.

[11] MATSUYAMA A, YOSHIMURA K, SHIMIZU C, et al. Characterization of glutamate decarboxylase mediatingγ-aminobutyric acid increase in the early germination stage of soybean (Glycine maxL. Merr)[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2009, 107(5): 538-543.

[12] KATAGIRI M, SHIMIZU S.γ-aminobutyric acid accumulation in bean sprouts (soybean, black gram, green gram) treated with carbon dioxide[J]. Nippon Shokuhin Kagaku Kougaku Kaishi, 1989, 36(11):916-919.

[13] GUO Yuanxin, CHEN Hui, SONG Yu, et al. Effects of soaking and aeration treatment onγ-aminobutyric acid accumulation in germinated soybean (Glycine maxL.)[J]. European Food Research and Technology,2011, 232(5): 787-795.

[14] 毛健, 馬海樂. 大豆發芽富集γ-氨基丁酸的工藝優化[J]. 食品科學,2009, 30(24): 227-331.

[15] REDDY V S, REDDY A S N. Proteomics of calcium-signaling components in plants[J]. Phytochemistry, 2004, 65(12): 1745-1776.

[16] ZHANG Hui, YAO Huiyuan, CHEN Feng, et al. Purification and characterization of glutamate decarboxylase from rice germ[J]. Food Chemistry,2007, 101(4): 1670-1676.

Optimization of GABA Accumulation Process of Germinated Soybean under Salt Stress

GUO Yuan-xin1,2，YANG Run-qiang，CHEN Hui1，SONG Yu1，GU Zhen-xin1,*
(1. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China；2. College of Food and Drug, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China)

Based on the single factor tests, the effects of NaCl content, culture time and culture temperature onγ-aminobutyric acid (GABA) accumulation during the germination of soybean (Glycine maxL.) were explored by response surface methodology(RSM). The objective of this study was to optimize the culture conditions for GABA production in germinated soybeans under salt stress. The results showed that the optimal conditions with salt stress for GABA accumulation in germinated soybean were NaCl content of 133.5 mmol/L, culture time of 5.5 days and culture temperature of 33.3 ℃. Under the optimal conditions, the predicted highest GABA yield was up to 1205.24 μg/g. Analysis of variance and validation experiments for the regression model suggested that the model could accurately predict GABA accumulation in germinated soybean under salt stress.

soybean；germination；salt stress；γ-aminobutyric acid accumulation；response surface methodology

TS201.1

A

1002-6630(2012)10-0001-05

2011-05-10

國家自然科學基金面上項目(31071581)；中央高?；究蒲袠I務費專項 (KYZ200917)

郭元新(1970—)，男，副教授，博士，研究方向為生物技術與食品資源高效利用。E-mail：guoyuanxiner@163.com

*通信作者：顧振新(1956—)，男，教授，博士，研究方向為農產品加工。E-mail：guzx@njau.edu.cn