酶催化菜籽油酸解制備結構脂質工藝

壽佳菲，潘麗軍,2,*，操麗麗,2，劉 模

(1.合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009；2.安徽省農產品精深加工重點實驗室，安徽 合肥 230009)

酶催化菜籽油酸解制備結構脂質工藝

壽佳菲1，潘麗軍1,2,*，操麗麗1,2，劉 模1

(1.合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009；2.安徽省農產品精深加工重點實驗室，安徽 合肥 230009)

以菜籽油和辛酸為原料，用來自Thermomyces lanuginosa固定化脂肪酶TL IM作為催化劑，采用單因素試驗結合響應曲面(Box-Behnken設計)優(yōu)化得到酶法制備結構脂質的工藝條件，最佳制備條件為底物(菜籽油:辛酸)物質的量比1:3.57、加酶量10.57%(以底物質量計)、加水量5.2%(以酶質量計)、反應溫度48.6℃、反應時間12h。該條件下辛酸插入率可達23.19%。對提高油菜籽油附加值、延長油菜加工產業(yè)鏈具有重要意義。

菜籽油；辛酸；酸解；結構脂質；響應曲面

結構脂質(structured lipids)，是對甘油三酯和脂肪酸經過改性或結構調整得到的脂，將特殊營養(yǎng)或生理功能的脂肪酸結合到特定位置，在保留天然油脂的部分或全部性質外，以最大限度發(fā)揮各種脂肪酸的功能，如能增強免疫力、易消化吸收、降低血脂、改善氮平衡、減少癌癥、心血管疾病、肥胖癥的患病風險等等[1]。有研究表明，脂肪酸的種類及其在甘油骨架上的位置與代謝途徑密切相關。甘油三酯在體內的代謝過程中脂肪酶只水解1,3位上的脂肪酸，而2位上的所有脂肪酸都以單甘酯的形式被吸收[2-4]。因此，1,3位是中(短)碳鏈脂肪酸、2位是長鏈脂肪酸的結構脂質的生產引起了國內外廣泛關注。

結構脂質的生產方法主要有物理法、化學催化法和酶合成法[5]。物理法是經過簡單的調和或分餾來制取，但不能改變甘油三酯中脂肪酸的分布，因此不能得到所需的產品。化學催化法一般以堿金屬為催化劑，反應條件強烈、無特異性、產物難以分離、難以得到期望的結構脂質[6]。而在酶法中，由于脂肪酶具有位置專一性和脂肪酸專一性，因此可避免上述兩種方法的缺點，并能在溫和的條件下，合成特定的結構脂質，且副產物少、產品易回收[6-7]。因此酶法合成結構脂質具有廣闊的應用前景。本實驗以商品化1,3特異性脂肪酶TL IM(來自Thermomyces lanuginosa)作為催化劑，一級精煉菜籽油和辛酸為底物，采用單因素實驗結合響應曲面(Box-Behnken設計)優(yōu)化酶催化酸解反應，確定最佳反應工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

一級精煉菜籽油 安徽省大平油脂廠；固定化脂肪酶 TL IM 丹麥諾維信公司；辛酸甲酯標準品 美國Sigma公司；豬胰脂肪酶 北京索萊寶科技有限公司；辛酸(98%) 國藥集團化學試劑有限公司；正己烷等其他試劑均為國產分析純或色譜純。

1.2 儀器與設備

SHY-2A型恒溫氣浴搖床 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；AR1140/C型電子天平 奧豪斯(上海)公司；GC-2010氣相色譜儀 日本島津制作所；臺式高速冷凍離心機 美國Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 菜籽油與辛酸的酸解反應

稱5.0g菜籽油和適量辛酸加入到50mL具塞錐形瓶中，加入一定量的固定化脂肪酶，在轉速150r/min、一定溫度條件下，密閉振蕩反應。定時取樣，分離純化以及甲酯化后用于分析辛酸插入率。

1.3.2 產物分離純化方法[8]

將過濾除去脂肪酶的混合產物置于分液漏斗中，加入適量正己烷溶解，用1g/mL的酚酞溶液作為指示劑，加堿皂化除去游離脂肪酸，無水乙醇-水(80:20，V/V) 溶液和蒸餾水多次洗滌干燥后，經旋轉蒸發(fā)后即得產物。

1.3.3 甲酯化方法[9-10]

取分離純化后的產物1mL 溶于2mL的色譜純正己烷中，加入適量無水硫酸鈉干燥后，取上清液，加入400μL KOH-甲醇溶液(1mol/L)，用力搖晃1min后，加入適量蒸餾水靜置分層，取上清液用無水硫酸鈉干燥后用于分析。

1.3.4 色譜分析條件

色譜柱：DB-WAX 毛細管柱(30m×0.25mm，0.25μm)；FID檢測器，溫度250℃；進樣口溫度230℃；升溫程序：60℃保持1 min，以50℃/min升至200℃，保持1min后，以3℃/min升至250℃，保留3min；氦氣流速30mL/min，進樣量1μL；分流比50:1。

1.3.5 辛酸插入率的計算

以樣品峰的保留時間與辛酸甲酯標準品的保留時間定性，按峰面積歸一法計算辛酸插入率。

1.3.6 單因素試驗

1.3.6.1 底物(菜籽油:辛酸)物質的量比的影響

在無溶劑體系中，加酶量為10%(以底物質量計)，加水量10%(以酶質量計)，反應溫度為50℃，轉速為150r/min，密閉反應一段時間，制備結構脂質。考察不同底物物質的量比(菜籽油:辛酸)對辛酸插入率的影響。

1.3.6.2 反應溫度的影響

選取1.3.6.1節(jié)的最適底物物質的量比，其他條件同

1.3.6.1節(jié)，考察不同反應溫度對辛酸插入率的影響。

1.3.6.3 加酶量的影響

選取1.3.6.2節(jié)的最適反應溫度，其他條件同1.3.6.2節(jié)，考察不同加酶量對辛酸插入率的影響。

1.3.6.4 加水量的影響

選取1.3.6.3節(jié)的最適加酶量，其他條件同1.3.6.3節(jié)，考察不同加水量對辛酸插入率的影響。

1.3.7 響應面優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎上，采用中心組合試驗Bo x-Behnken設計，因素及其水平如表1所示。

表1 酶法制備結構脂質響應面優(yōu)化試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of RSM

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 底物物質的量比對辛酸插入率的影響

在脂肪酶催化酸解反應中，反應達到平衡后產物的組成與底物物質的量比有密切關系。由圖1可知，底物物質的量比(菜籽油:辛酸)為1:3時辛酸插入率相對較高，原因可能是高水平的游離脂肪酸會產生大量的羧酸基團，從脂肪酶表面奪取部分必需水，而且可以從油水界面進入到周圍的水層中，導致底物抑制效應的發(fā)生[11]。

圖1 底物物質的量比對辛酸插入率的影響Fig.1 Effect of substrate molar ratio on the incorporation rate of caprylic acid

2.1.2 反應溫度對辛酸插入率的影響

酶催化酸解反應時一個熱力學反應，反應溫度的高低不僅影響底物的溶解狀態(tài)及黏度，而且影響底物在反應體系中的傳質[12]。另外，溫度也影響著酶的活性。由圖2可知，溫度越高，辛酸插入率越高。高溫有助于反應底物的互溶，增加底物的接觸面積，加快反應速度，縮短反應時間[12]。但是溫度從40℃升高到50℃時，辛酸插入率增加很快，而50℃后增加趨勢放慢。考慮到較高溫度對酶的活性影響很大，選擇反應溫度為50℃左右較為合適。

圖2 反應溫度對辛酸插入率的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on the incorporation rate of caprylic acid

2.1.3 加酶量對辛酸插入率的影響

圖3 加酶量對辛酸插入率的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on the incorporation rate of caprylic acid

圖3表明，隨著酶量的增加，辛酸插入率逐漸增大，但是到10%后，辛酸插入率增大得很緩慢，可能是隨著酶量的增加，底物與酶分子接觸的機會增多，加速了酸解反應的進行[13]。但是酸解反應是復雜的可逆反應，酶量的增加也加速了逆反應的進程和油脂水解反應，同時，在無溶劑體系中，酶量的增加可能會提高體系的黏度，影響傳質，同時也會加大成本。綜合考慮，適宜酶添加量為10%左右。

2.1.4 加水量對辛酸插入率的影響

脂肪酶只有在油-水界面才具有催化活性，因此水是維持酶活性的必要條件，然而反應體系中水分含量超過一定限度，反應會向水解方向進行，使反應混合物中游離脂肪酸含量增加，產品得率降低，但水分過低又會影響酶分子表面的水分子層，進而影響酶分子的構象和活性[14-15]。

圖4 加水量對辛酸插入率的影響Fig.4 Effect of water addition amount on the incorporation rate of caprylic acid

由圖4可以看出，在水添加量低于10%時，辛酸插入率是隨著水量的增加而增大的，可能是由于在水量添加較低時，酶的活性隨水量的增加而增大。然而當水量繼續(xù)增加到15%時，辛酸插入率開始降低，過多的水反而使底物的水解、酰基轉移等副反應發(fā)生[16-17]。

2.1.5 反應時間對辛酸插入率的影響

從圖1～4可以看出，隨著反應時間的延長，辛酸插入率逐漸升高，且在1～12h內辛酸插入率增加迅速，而在12～24h辛酸插入率增加非常緩慢，說明在12h左右反應已基本達到穩(wěn)定狀態(tài)，因此再延長反應時間沒有實際意義。綜上分析，選擇反應時間為12 h。

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面試驗結果與分析

表2 酶法制備結構脂質響應面優(yōu)化試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface tests for optimizing the incorporation of caprylic acid

按表1試驗方案，采用多元回歸分析，擬合二次多項式回歸模型的Box-Behnken設計。所有實驗重復3次，結果取平均值，見表2。

2.2.2 回歸模型的建立及其顯著性檢驗

由Design－Expert 7.0 軟件，通過對多項式回歸分析，得到的擬合全變量二次回歸方程模型為：

由回歸方程可知，交互項的系數(shù)較小，說明響應面分析所選的4個因素之間交互作用較小。由表3可知，在α＝0.01水平上，該模型失擬不顯著，回歸方程顯著。模型的決定系數(shù)R2為98.46549%，模型的擬合程度很好，能較好地反映各因素與響應值變化的關系，可以用于結構脂質中辛酸插入率的理論預測。

表3 回歸模型的方差分析表(α＝0.01，置信度99%)Table 3 Analysis of variance for the fitted quadratic regression equation

2.2.3 響應因素水平的優(yōu)化及模型驗證

對回歸模型進行響應面分析，尋找最優(yōu)組合條件，得到當?shù)孜镂镔|的量比(菜籽油:辛酸)1:3.57、加酶量10.57%(以底物質量計)、加水量5.2%(以酶質量計)、反應溫度48.6℃、反應12h后辛酸插入率的理論最高值可達到25.77%。

為了進一步驗證上述模型與預定的可靠性，按上述組合條件進行驗證實驗，重復3次，得到辛酸的平均插入率為23.19%，與預測值很接近，說明該模型擬合較好。

3 結 論

通過響應面法優(yōu)化得出最優(yōu)條件為底物物質的量比(菜籽油:辛酸)1:3.57、加酶量10.57%(以底物質量計)、加水量5.2%(以酶質量計)、反應溫度48.6℃。在此條件下反應12h，實測辛酸插入率為23.19%，與模型預測值25.77%非常接近。說明采用固定化脂肪酶TL IM催化菜籽油和辛酸合成結構脂質的方法過程簡單，條件溫和，產物易于分離，有應用生產的潛力。

[1] RUBIN M, MOSER A, VASERBERG N, et al. Structured triacylglycerol emusion, containing both medium and long-chain fatty acids, in longterm home parenteral nutrition: a double- blind randomized cross- over study[J]. Applied Nutritional Investigation, 2000, 16(2): 95-100.

[2] MU Huiling, HOY C E. The digestion of dietary triacylglycerols[J].Progress in Lipid Research, 2004, 43(2): 105-133.

[3] 劉燕萍, 李寧, 張思遠. 中鏈甘油三酯的代謝特點及臨床應用研究進展[J]. 營養(yǎng), 2001, 8(1): 54-56.

[4] ROYNETTE C E, RUDKOWSKA I, NAKHASI D K, et al . Structured medium and long chain triglycerides show short-term increases in fat oxidation, but no changes in adiposity in men[J] Nutrition, Metabolism and Cardiovascular Diseases, 2008,18(4): 298-305.

[5] 王瑛瑤. 新型功能性油脂: 結構脂質的研究現(xiàn)狀[J]. 食品研究與開發(fā), 2008, 29(4): 162-165.

[6] 陳翔, 王瑛瑤, 欒霞, 等. 無溶劑體系中酶催化合成結構脂質條件初探[J]. 中國油脂, 2010, 35(3): 35-38.

[7] HITA E, ROBLES A, CAMACHO B, et al. Production of structured triacylglycerols by acidolysis catalyzed by lipases immobilized in a packed bed reactor[J]. Biochemical Engineering Journal, 2009, 46(3): 257-264.

[8] MARIA E C, GUILLERMO H C. Enzymatic acidolysis of sunflower oil with a palmitic-stearic acid mixture[J]. Journal of Food Engineering,2008, 84(2): 243-249.

[9] 李桂華. 油料油脂檢驗與分析[M]. 北京: 化學工業(yè)出版社, 2006: 107.

[10] 寇秀萍, 于國萍. 脂肪和脂肪酸甲酯化方法的研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2005, 26(2): 46-47.

[11] 郭玉寶, 裘愛泳, 徐霞. 酶促酯交換制備定向結構脂研究[J]. 糧食與油脂, 2001(8): 31-33.

[12] SENANAYAKE N S P J, SHAHIDI F. Enzyme-catalyzed synthesis of structured lipids via acidolysis of seal (Phoca groenlandica) blubber oil with capric acid[J]. Food Research International, 2002, 35(8): 745-752.

[13] KIMA I H, YOON C S, CHO S H, et al. Lipase-catalyzed incorporation of conjugated linoleic acid into tricaprylin[J]. Journal of the American Oil Chemists' Society, 2001, 78(5): 547-551.

[14] GARCIA H S, ACROS J A, KEOUGH K J, et al. Immobilized lipase -mediated acidolysis of butter oil with conjugated linoleic acid: batch reactor and packed bed reactorstudies[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2001, 11(4/6): 623-632.

[15] 孟祥河, 鄒東芽, 段作營, 等. 無溶劑體系中合成1,3 -甘油二酯用脂肪酶的篩選及其酯化性質的研究[J]. 無錫輕工大學學報, 2004, 23(2): 31-35.

[16] FORESTI M L, FERREIRA M L. Lipase-catalyzed acidolysis of tripalmitin with capric acid in organic solvent medium: analysis of the effect of experimental conditions through factorial design and analysis of multiple responses[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2010, 46(6):419-429.

[17] BEKYAS I, YUCEL S, USTUN G, et al. Production of reduced calorie structured lipid by acidolysis of tripalmitin with capric acid: optimisation by response surface methodology[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2008, 88(11): 1927-1931.

Lipase-Catalyzed Acidolysis of Rapeseed Oil for Preparing Structural Lipids

SHOU Jia-fei1，PAN Li-jun1,2,*，CAO Li-li1,2，LIU Mo1
(1. School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China；2. Key Laboratory for Agricultural Products Processing of Anhui Province, Hefei 230009, China)

In this study, the lipase (fromThermomyces lanuginosa)-catalyzed acidolysis process of rapeseed oil with caprylic acid was investigated to prepare structural lipids using single factor and response surface tests. The results showed that the incorporation rate of caprylic acid reached up to 23.19% at the conditions of the molar ratio between rapeseed oil and caprylic acid of 1:3.57, immobilized lipase addition amount of 10.57%, water addition amount of 5.2%, reaction temperature of 48.6 ℃and reaction time of 12 h. This investigation will be significance for improving the additional value of rapeseed oil and extending its industry chains.

rapeseed oil；caprylic acid；acidolysis；structural lipids；response surface methodology

TS229

A

1002-6630(2012)10-0029-04

2011-05-07

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2011BAD02B04)

壽佳菲(1985— )，女，碩士研究生，研究方向為食品資源綜合利用。E-mail：shoujiafei@163.com

*通信作者：潘麗軍(1955—)，女，教授，碩士，研究方向為農產品資源綜合利用。E-mail：panlijun1955@163.com