提高鴨蛋蛋清蛋白凝膠強度的酰化改性工藝優化

王 玲，鄭 優，陳厚榮，汪學榮,*，彭祥偉

(1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶市畜牧科學研究院，重慶 402460)

提高鴨蛋蛋清蛋白凝膠強度的酰化改性工藝優化

王 玲1，鄭 優1，陳厚榮1，汪學榮1,*，彭祥偉2

(1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶市畜牧科學研究院，重慶 402460)

以鴨蛋蛋清蛋白為原料，通過琥珀酸酐酰基化改性以提高鴨蛋蛋清蛋白的凝膠強度。在單因素試驗的基礎上，選擇琥珀酸酐與蛋清蛋白質的添加比例、反應溫度、反應時間、反應pH值4個因素為自變量，以蛋白凝膠強度為響應值，進行中心組合試驗，建立鴨蛋蛋清蛋白的凝膠強度的二次回歸方程，并通過響應面(Box-Behnken)分析，得到優化組合條件。結果表明：經過修正最優工藝為琥珀酸酐與蛋清蛋白質的添加比0.118:1、反應時間35.24min、反應溫度22.91℃、反應pH8.09，在此條件下鴨蛋蛋清蛋白的凝膠強度預測值為324.66N，與驗證值319.56N接近，優化結果可靠。

鴨蛋蛋清蛋白；酰基化改性；凝膠強度；優化

蛋清蛋白凝膠是通過加熱使適度變性的球蛋白質分子首尾聚集，形成一個有規則的蛋白質網狀結構，此結構能保持大量水分。蛋清蛋白凝膠因其可包裹大量的水分及風味物質，同時可使肉糜中的水分、脂肪、蛋白質、淀粉等形成穩定均勻的體系[1]，提高產品的咀嚼性、嫩度、風味、切片穩定性等而廣泛用于食品中[2]。但未改性蛋清蛋白凝膠強度弱、透明性差、一定程度上限制了其在食品行業的應用。近年來鴨蛋產量激增[3]、且營養豐富[4]，而其主要的消費途徑再制蛋市場有限，商品附加值低。對于禽蛋各項應用性質的基礎研究以及深加工技術的研發成為擴大其應用范圍、提高商品附加值、增加農民收益、滿足工業生產需要的重要壁壘。目前已有人從鴨蛋蛋黃中提取較純的分離蛋白[5]，制作蛋黃粉[6]等，但對蛋清的研究主要集中在蛋白粉的干燥方法上[7-8]，對蛋清蛋白的改性主要集中在對蛋清蛋白乳化性能、起泡性的影響上[9-13]，很少有人研究對對其凝膠應用性能有改善作用的改性技術。作為一種新型的食品功能添加成分，因卵傳鐵蛋白會干擾纖維狀結構的形成[14]等原因，蛋清蛋白形成凝膠的持水性、熱穩定性、黏彈性、凝膠強度等有待提高，因此研究提高鴨蛋蛋清蛋白凝膠性能的酰基化技術為提高鴨蛋附加價值，發展天然添加劑，擴大鴨蛋蛋清蛋白在食品行業中的應用范圍，促進我國禽蛋業健康快速發展有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

白殼鮮鴨蛋 重慶市購。

透析袋(14000) 上海源葉生物科技有限公司；琥珀酸酐、茚三酮 成都市科龍化工試劑廠；其他試劑均為國產分析純。

TA.XT2i型質構儀 英國Stable Micro System公司；PB-10精密pH計 德國賽多利斯公司；DK-8D三孔電熱恒溫水槽 上海齊欣科學儀器有限公司；90-2型定時恒溫磁力攪拌器 上海滬西分析儀器廠；721型分光光度計 上海現科儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酰化反應

工藝流程：蛋黃、蛋清分離→紗布過濾→加入琥珀酸酐→維持一定pH值→透析袋透析24h。

操作要點：室溫條件下，使用漏斗將新鮮鴨蛋的蛋清與蛋黃分離，并使用大孔紗布過濾，除去蛋清中的系帶雜質備用。在一定的溫度下分批加入琥珀酸酐并攪拌，反應過程中用1mol/L的NaOH溶液調節pH值，一定反應時間后取出置于透析袋中透析(4℃，24h)，透析后液體取出定容至相同體積備用。

1.2.2 酰化度測定[15]

配制茚三酮溶液，采用茚三酮比色法測定蛋白質的酰基化程度。計算酰化度：

1.2.3 凝膠制備

取20g蛋清按1.2.1節方法反應后透析，取出并加水至體積為30mL。置于100mL燒杯中，用錫泊紙封好燒杯口，放入90℃的水浴鍋中加熱30min，取出后用流水冷卻30min以上，放于4℃冰箱中過夜，形成凝膠備用。

1.2.4 凝膠質構特性測定條件[16-17]

凝膠強度用質構儀測定。質構儀操作條件：采用p0.5探頭，測試前速度5.0mm/s，測試速度2.0mm/s，測試后速度2.0mm/s，將下壓凝膠10mm所需力定義為凝膠強度。將制備好的凝膠取出，于室溫分別測量3個點的凝膠強度，以平均值作為最終的凝膠強度值。

1.3 實驗設計

1.3.1 單因素試驗

選取蛋白質與琥珀酸酐的反應底物比例、反應時間、反應溫度、反應pH值4個因素對酰化改性鴨蛋蛋清蛋白的酰化度以及制備凝膠的凝膠強度進行研究，以確定酰化改性對凝膠強度的作用。試驗均做3個重復，按照1.2.4節方法測定凝膠強度，結果以3次測定結果的平均值表示。

1.3.2 響應面優化試驗設計[18-20]

在單因素試驗基礎上，采用四因素三水平的Box-Behnken響應面試驗設計方法，以反應底物比例、反應時間、反應溫度、反應pH值為考察因素，以反應后蛋清形成凝膠的強度為指標進行優化。

1.3.3 數據統計分析

采用Design-Expert軟件(Version 7.1 Stat-Ease Inc.Minneapolis，MN，USA)對響應面試驗得到的數據進行線性回歸和方差分析，模型及因素的顯著性均通過F值考察(P＜0.05)，所有試驗均做3個重復，結果以平均值表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 琥珀酸酐與蛋清蛋白添加比例對鴨蛋蛋清蛋白凝膠強度的影響

圖1 反應底物比例對酰化度和凝膠強度的影響Fig.1 Effect of proportion of egg whites to succinic anhydride on acylation degree and gel strength

取20g過濾蛋清，分別分批加入0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25g/g倍比例的琥珀酸酐，于室溫反應30min，過程中加入1mol/L NaOH溶液維持溶液pH8，透析并制備凝膠，測定其酰化度及質構特性見圖1。該單因素試驗加入酸酐比例最高為0.25g/g，遠低于國內常用比例[21]，琥珀酸酐作為一種廣泛應用的食品調味劑、醫藥原料、改性劑，其食用也較為安全，且未有食品中最大允許使用量的限制。為保證凝膠過程不受酸酐影響，本實驗中多余的未反應的酸酐在透析過程中除去。由圖1可看出，隨著加入琥珀酸酐比例的增加，酰化度不斷增加，而凝膠強度則在琥珀酸酐與蛋白質的質量比為0～0.1的范圍內不斷增高并達到最大值226.24；在0.1～0.3的比例范圍內則不斷降低。因此確定最佳反應比例為0.1左右，且此時酰化度約為75%，證明酰化反應引起了凝膠強度的變化。

2.1.2 反應時間對鴨蛋蛋清蛋白凝膠強度的影響

圖2 反應時間對酰化度和凝膠強度的影響Fig.2 Effect of reaction time on acylation degree and gel strength

取20g過濾蛋清，分批加入0.1倍比例的琥珀酸酐，于室溫下分別反應0、10、17、24、31、38min，過程中加入1mol/L NaOH溶液維持溶液pH8，透析、制備凝膠。由圖2可看出，在反應時間為31min之前，隨反應時間的延長，凝膠強度逐漸增加；反應31min之后，隨時反應時間的延長，凝膠強度逐漸減少，而酰化度則緩慢增長。反應31min時凝膠強度有最大值205.58N，酰化度為與2.1.1相似的68%，依據凝膠強度，確定31min左右為最佳反應時間。

2.1.3 反應溫度對鴨蛋蛋清蛋白凝膠強度的影響

圖3 反應溫度對酰化程度和凝膠強度的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on acylation degree and gel strength

取20g過濾蛋清，分批加入0.1倍比例的琥珀酸酐，分別在20、25、30、35、40、45℃條件下反應31min，過程中加入1mol/L NaOH溶液維持溶液pH8，透析、制備凝膠，測定凝膠強度、酰化度。由圖3可知：凝膠強度在溫度在25～35℃時緩慢升高，高于35℃之后便不斷下降。在35℃時達到峰值327.96N，此時酰化度依舊為70%左右，因此確定30～35℃為最佳反應溫度。

2.1.4 反應pH值對鴨蛋蛋清蛋白凝膠強度的影響

圖4 反應pH值對凝膠強度的影響Fig.4 Effect of reaction pH value on acylation degree and gel strength

取20g過濾蛋清，分批加入0.1倍比例的琥珀酸酐，在35℃條件下反應31min，過程中添加1mol/L NaOH和0.1mol/L的檸檬酸溶液分別維持溶液pH6、7、8、9、10，透析制備凝膠，測定結果見圖4。在反應pH值低于7時，凝膠強度隨著pH值的升高而升高，當pH7～10時，凝膠強度隨著pH值的升高而降低。在pH7、8時有較大值，249.32和211.25，因此確定pH7～8為最佳反應pH值。且此時的酰化度為72.158%，與前面所測酰化度相似，證明一定的酰化比例可以提高凝膠強度。

2.2 響應面試驗

根據單因素試驗結果，設定酸酐與蛋白質反應比例(反應底物比例)為0.05～0.15g/g之間，反應溫度在30～40℃之間，反應時間在24～38min之間，反應pH值在6～8之間；以酰化改性后蛋清蛋白凝膠強度為指標，采用Box-Behnken響應面設計法優化反應條件。試驗因素編碼和水平如表1所示，試驗安排及結果如表2所示。

表1 響應面分析因素與水平Table 1 Factors and levels for RSM

表2 響應面分析方案及試驗結果Table 2 Experimental trials of RSM and experiment results

2.2.1 二次多項式回歸模型的建立

通過分析可以得到反應條件與凝膠強度之間的二次多項式模型為：

F檢驗反映的是回歸模型的有效性，包括失擬性檢驗和回歸方程顯著性檢驗。方差分析(ANOVA)(表3)和模型可信度分析(表4)顯示：方程復相關系數的平方R2＝0.861，說明該模型極顯著(P＜0.001)；失擬項在0.05水平上不顯著(P＝0.0683＞0.05)；RAdj2為0.721，說明建立的模型能夠解釋72.1%響應值的變化，能很好地描述凝膠強度隨酰化反應條件的變化規律。因此該模型可很好地用于預測酰化反應條件對蛋清蛋白凝膠強度的影響。

表3 凝膠強度的二次響應模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model of gel strength

由表3可知：一次項中X1、X4的偏回歸系數極顯著，說明反應底物比例和反應pH值對酰化蛋清蛋白凝膠強度有極顯著影響；二次項中X42的偏回歸系數極顯著水平。

表4 模型可信度分析Table 4 Reliability analysis for response surface quadratic model of gel strength

2.2.2 兩因素間的交互作用分析

采用Design-Expert軟件根據多元回歸擬合分析處理反應底物比例、反應時間、反應溫度、反應pH值4個因素對鴨蛋蛋清凝膠強度影響的響應面分析結果見圖5。由圖可見，響應值存在極值，可以得到預期優化結果。

圖5 各兩因素交互作用對凝膠強度影響的響應面分析Fig.5 Response surface plots of the interactive effects of reaction temperature and reaction pH on gel strength

2.3 酰化改性工藝回歸模型的優化和驗證實驗

通過優化得到最佳工藝并根據實際情況修正為琥珀酸酐與蛋白質的反應比例0.118、反應時間35.24min、反應溫度22.91℃、反應pH8.09。在上述響應面分析結果確定的最佳工藝條件下進行3次酰化反應驗證實驗，得到凝膠的平均強度為(319.56±10.13)N，與預測值324.66N基本一致，僅與預測值相差1.5709%，說明模型與試驗數據擬合較好，優化結果可靠。

3 結 論

通過采用Design-Expert軟件分析反應底物比例、反應時間、反應溫度和反應pH值4因素對蛋清蛋白凝膠強度的影響，得到酰化改性提高鴨蛋蛋清蛋白凝膠強度工藝參數的回歸方程為：Y＝255.14＋52.78X1＋8.90X2－6.43X3＋105.61117X4－0.81X1X2－2.27X1X3＋0.43X1X4－2.87X2X3＋1.41X2X4－4.10X3X4－15.07X12－20.53116X22－11.80X32－49.90X42。方差分析結果表明擬合檢驗極顯著，決定系數達0.861，該方程能較好的預測凝膠強度隨各因素變化的規律。

根據回歸方程和實際情況得到最優的工藝條件為琥珀酸酐與蛋白質反應的質量比0.118:1、反應時間35.24min、反應溫度22.91℃、反應pH8.09，得到蛋清蛋白凝膠強度的預測值為324.66N。在此優化條件下進行驗證實驗，測得蛋白凝膠的強度為(319.56±10.13)N，與預測值接近，說明該模型可以很好地預測酰化反應條件與酰化蛋清蛋白凝膠強度之間的關系，優化結果可靠。

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Optimization of Acylation Modification for Enhancing Gel Strength of Duck Egg White Protein by Response Surface Methodology

WANG Ling1，ZHENG You1，CHEN Hou-rong1，WANG Xue-rong1,*，PENG Xiang-wei2
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2. Chongqing Academy of Animal Science, Chongqing 402460, China)

The objective of the current study was aimed to improve gel strength of duck egg white by means of acylation modification. Based on the single factor test, the proportion of egg whites to succinic anhydride, reaction temperature, reaction time and reaction pH value were selected as independent variables, gel strength of protein as dependent variable, quadratic regression equation of gel strength of duck egg white was established through central composite test. The optimal condition was obtained by response surface methodology (RSM). Results showed that the optimum condition for the reaction was proportion of egg whites to succinic anhydride being 0.118, reaction temperature being 22.9 ℃, reaction time lasting for 35.2 min and reaction pH value being 8.1. Under this condition the gel strength of duck egg white protein achieved to 319.56 N, approaching to the predicted value, so the optimized result was reliable.

duck egg white protein；acylation modification；gel strength；optimization

TS253.1

A

1002-6630(2012)10-0039-06

2011-06-16

現代農業(水禽)產業技術體系建設專項(nycytx-45-15)；西南大學博士基金項目(09BSr07)

王玲(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為農產品加工及貯藏。E-mail：tianmishuijing@163.com

*通信作者：汪學榮(1972—)，男，副教授，博士，研究方向為食品化學與營養學。E-mail：wxr13099@163.com