響應曲面法優化大蒜中總酚提取工藝及其抗氧化活性測定

杜俊娜，陳書霞*，程智慧，常燕霞，周 靜

(西北農林科技大學園藝學院，農業部西北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，陜西 楊凌 712100)

響應曲面法優化大蒜中總酚提取工藝及其抗氧化活性測定

杜俊娜，陳書霞*，程智慧，常燕霞，周 靜

(西北農林科技大學園藝學院，農業部西北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，陜西 楊凌 712100)

采用響應曲面法對料液比、提取時間、不同體積分數酸化甲醇提取劑3個因素進行優化，以料液比、提取時間、不同體積分數酸化甲醇提取劑為自變量，總酚提取量為響應值，利用Box-Behnken設計原理和響應曲面法，研究各自變量及其交互作用對總酚提取的影響，模擬求得二次多項回歸方程的預測模型，并確定料液比1:14(g/mL)、提取時間31min、80%酸化甲醇為提取劑是最佳的提取條件。在此條件下，總酚提取量為0.67mg GAE/g，模型預測值偏差為6.9%，證明所選工藝條件為最佳工藝條件。同時，用5種方法對其抗氧化活性進行測定，結果表明大蒜具有良好的抗氧化活性。

大蒜；總酚提取量；抗氧化活性；響應曲面法

大蒜(Allium sativumL.)為百合科蔥屬植物，在我國南北均有種植，是人們日常生活中傳統的調味料和傳統的藥食同源植物。因其含有維生素、硒和含硫化合物等多種生理活性成分，因此在抗動脈粥樣硬化[1]、抗癌[2]、保健和預防[3]、治療多種慢性疾病[4]等領域有著廣泛的應用，而這些應用與它們的抗氧化活性密不可分。據研究，成熟大蒜及其成分在內皮細胞中皆表現出抗氧化性損傷的功能[5]，并可在一定程度上抑制癌細胞的增長[6]，因此，大蒜常常被當做是功能性的食品原料被加以利用[7]。

大蒜總酚不僅是一種天然無毒的抗氧化劑，也是理想的天然藥物，具有清除自由基、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等作用。同時在醫藥、化妝品、農用化學品等領域也具有重要的應用。在目前大蒜多酚提取的工藝方法中，超聲波提取法具有提取效率高、不需高溫、能耗低、提取時間短等特點。但對于大蒜料液比、提取時間、不同體積分數提取劑等工藝參數尚有較少的研究對其進行優化。

響應曲面法(response surface methodology，RSM)是一種優化反應條件和加工工藝參數的有效方法，可用來進行建模、檢驗模型合適性、因子效應的評估、考察以及尋求因子的最佳操作條件等[8]。近年來響應曲面法已成功地應用于天然化合物提取優化實驗[9]，與正交試驗設計相比，具有試驗周期短，回歸方程的精度高，能同時研究幾種因素間的交互作用等優點[10]。

本研究在單因素試驗基礎上，利用響應曲面法對大蒜中總酚的提取工藝進行優化，分析料液比、提取時間、不同體積分數提取劑對總酚提取得率的影響，建立總酚提取的數學模型。并采用5種方法分析大蒜的抗氧化活性，為大蒜醫學功能的評價和相關產品的開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大蒜(Allium sativumL.)鱗莖于2010年8月取自西北農林科技大學園藝場大蒜資源圃。采新鮮鱗莖－20℃保存備用。

福林肖卡試劑、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl，DPPH)、新亞銅、啡咯嗪、rolox標樣 美國Sigma公司。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

SHIMADZU UV-1700型紫外分光光度計 日本島津公司；ZMQS 5001型超純水制備儀 法國Milipore公司；SORVAIL RC-SC-PLUS型高速冷凍臺式離心機 美國Kendro公司；KQ-300DE型數控超聲波機 昆山儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取工藝

準確稱取一定量的大蒜鱗莖于研缽中，加入液氮研磨至粉末，轉移至50mL離心管中，再加入相應量的不同提取液，在20℃條件下進行超聲波提取，10000r/min離心10min，轉移上清至絲口瓶中，－20℃貯存備用。

1.3.2 提取條件優化方案

根據單因素試驗，選取對試驗結果影響較大的因素，采用Box-Benhnken模型進行試驗設計，用Design Expert 7.0軟件進行響應面優化分析。

1.3.3 總酚提取量的測定

采用Folin-Ciocalteu(FC)法[11]。移取待測溶液300μL提取液，加入700μL蒸餾水，混合均勻后，加入200μL福林肖卡(FC)試劑，混合萃取1min后，加入2mL Na2CO3(10%)溶液，室溫避光靜置2h后，于波長765nm處測吸光度。以沒食子酸為標準品，繪制標準曲線，得回歸方程y＝17.179x＋0.0147，r2＝0.9991，根據標準曲線方程求出提取液中總酚質量濃度/(mg GAE/g，GAE(gallic acid equivalent)表示沒食子酸等效物)。

1.3.4 抗氧化活性的測定

1.3.4.1 DPPH清除力

通過檢測試驗樣品對有機自由基DPPH的清除能力可以評價其抗氧化性的強弱。試驗測定參照Mimica等[12]的方法。DPPH清除率按下式計算。

式中：Ai為試驗樣品吸光度；Ac為空白對照吸光度。

1.3.4.2 羥自由基清除力

對·OH的清除能力測定參照Sakanaka等[13]的方法。清除率按下式進行計算。

式中：Ai為試驗樣品吸光度；Ac為空白對照吸光度。

1.3.4.3 鐵氰化鉀還原力

樣品的還原能力與抗氧化能力呈正相關，參照Oyaizu[14]的方法進行測定，還原能力的強弱以波長700nm處的吸光度表示。

1.3.4.4 銅離子還原力

取1mL提取液，分別加入1mL CuSO4·5H2O(5mmoL/L)，1mL新亞銅(3.75mmoL/L)，于37℃反應30min，450nm波長處測吸光度。Trolox作標品，繪制標準曲線，得回歸方程y＝0.0016x－0.0175，r2＝0.998，根據標準曲線方程求出提取液中銅離子還原能力相當于trolox的含量的質量濃度。結果用mg(trolox等同量)/g表示。

1.3.4.5 金屬螯合力

對亞鐵的螯合能力測定參照Ak等[15]的方法。螯合率按下式進行計算。

式中：Ai為試驗樣品吸光度；Ac為空白對照吸光度。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比對大蒜中總酚提取量的影響

圖1 料液比對總酚提取量的影響Fig.1 Effect of material / liquid ratio on yield of total phenolic compounds

以80%酸化甲醇為提取劑，提取時間為30min的條件下，以料液比1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30(g/mL)進行試驗，不同料液比對大蒜總酚提取量的影響見圖1。由圖1可知，隨著液體比例的逐漸增加，總酚提取量呈增大趨勢。但當料液比達到一定量時，提取劑對有效成分的提取達到飽和。再增加提取劑的量，雜質成分會競爭溶出而不利于有效成分的提取。而且會造成的浪費，成本增加。因此，在保證提取效果的同時，可減少提取劑的用量。綜合考慮，料液比以控制在1:15(g/mL)為宜。

2.1.2 提取時間對大蒜中總酚提取量的影響

圖2 提取時間對總酚提取量的影響Fig.2 Effect of extraction time on yield of total phenolic compounds

以80%酸化甲醇為提取劑，料液比1:10(g/mL)的條件下，以提取時間20、30、40、50、60min進行試驗，不同提取時間對總酚提取量的影響見圖2。

由圖2可知，隨著時間延長，總酚提取量逐漸增加，在30min前增加較明顯，說明時間越短提取越不充分，在30min后總酚提取量開始下降，之后回升，趨勢平緩，說明大蒜中抗氧化物質已基本提取完，為縮短工時、節省能源，選取最佳提取時間為30min。

2.1.3 提取劑體積分數對大蒜中總酚提取量的影響

在料液比為1:10(g/mL)，提取時間30min條件下，分別用50%、60%、70%、80%、90%、100%的酸化甲醇進行提取。不同體積分數提取劑對總酚提取量的影響見圖3。由圖3可知，80%酸化甲醇提取率最高，所以選擇80%酸化甲醇為最佳提取劑。

圖3 提取劑體積分數對總酚提取量的影響Fig.3 Effect of concentration of extracting agents on yield of total phenolic compounds

2.2 響應面法提取條件的優化

2.2.1 響應面試驗設計及結果

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken中心組合試驗設計原理，以料液比、提取時間和不同體積分數提取劑3個外界因素為自變量，以總酚提取量為響應值即因變量，因素編碼及水平見表1，試驗設計及結果見表2。

表1 響應面試驗因素水平編碼表Table 1 Variables and levels in three-variable-three-level Box-Behnken experimental design

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Trials and results of the three-variable-three-level Box-Behnken experimental design

利用Design Expert 7.0軟件，對表2的試驗數據進行處理，得到回歸方程方差分析表，見表3。同時利用該軟件進行非線性回歸分析，得到預測模型如下：

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variances for the developed regression equation

由表3可以看出，F回歸＝5.33，P＝0.0191＜0.05，表明模型效應顯著，不同處理間的差異顯著；各因素中A2、B2、C2效應均顯著；A、B、C、A B、A C、BC效應不顯著，由此可見，各具體試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。F失擬＝0.64，說明失擬項與凈誤差沒有顯著的關聯，失擬項P＝0.6262＞0.05，不顯著，說明回歸方程擬合程度良好。R2＝0.8727，說明該回歸方程回歸效果較好；模型的調整決定系數R2Adj＝0.7091，說明該模型能解釋70.91%響應值的變化，因而該模型擬合程度良好，實驗誤差小，可信度高，該模型是合適的，可以用此模型對總酚提取量提取工藝進行分析和預測。

2.2.2 各因素及交互作用對總酚提取量的影響

圖4 各兩因素交互作用對總酚提取量影響的等高線及響應面圖Fig.4 Response surface plots of the interactive effects of extraction time and concentration of extracting agents on yield of total phenolic compounds

由圖4a可知，以80%酸化甲醇為提取劑，料液比和提取時間對大蒜中總酚提取量的交互影響。在提取時間不變的條件下，隨著提取劑用量的逐漸增加，總酚提取量出現先上升后下降的趨勢，變化較不顯著。這可能是當料液比變大時，大蒜中的總酚類物質與提取劑在單位時間內存在較大的質量濃度梯度，擴散系數大，擴散速率大。隨著時間的延長，有效組分在提取劑中的溶解基本趨于飽和，再加大料液比也不會促進提取。在料液比不變的條件下，隨著時間的逐漸延長，總酚提取量也出現了先上升后下降的趨勢，變化較為顯著，這說明總酚提取量隨著時間的延長而增加，當達到飽和時，再延長提取時間，反而會抑制總酚類物質的提取。

由圖4b可知，在30min提取時間下，料液比和提取劑體積分數對大蒜中總酚提取量的交互影響。在料液比不變的條件下，總酚提取量隨提取劑體積分數的升高先增加后降低，提取劑體積分數大致在80%時，總酚提取量最高，70%和90%時，總酚提取量較低。在提取劑濃度不變的條件下，隨著提取劑用量的逐漸增加，總酚提取量出現先上升后下降的趨勢。這可能是因為料液比的增大會使大蒜中的總酚類物質得到更充分地釋放，總酚提取量上升，當大蒜中的總酚提取接近完全時，再繼續增大提取劑用量，總酚提取量則出現下降。

由圖4c可知，在1:15(g/mL)料液比條件下，提取時間和提取劑體積分數對大蒜中總酚提取量的交互影響。在提取時間不變的條件下，同料液比和不同體積分數提取劑的交互作用，以80%酸化甲醇為提取劑的總酚提取量最高。在提取劑體積分數不變的條件下，隨著提取時間的增加，總酚提取量出現先上升后下降的趨勢。其原因可能是在剛開始提取的時候，大蒜中的總酚類物質與提取劑在單位時間內存在較大的質量濃度差，擴散速度快，總酚提取量較高，隨著時間的延伸，部分組織的有效組分的結構破壞，導致總酚提取量下降。

綜合圖4，在模型濃度范圍內選擇出發點，按照模型(1)使用快速上升法進行提取工藝的優化，提取的最佳條件為料液比1:13.76(g/mL)、提取時間30.91min、提取劑體積分數79.92%，在此條件下總酚提取量的理論值0.72mg GAE/g，可信度為0.7091。

2.2.3 最佳工藝參數的驗證

在最佳條工藝件下進行驗證實驗，修正工藝參數為料液比1:14(g/mL)、提取時間31min、用80%酸化甲醇為提取劑，實際測得的總酚提取量0.67mg GAE/g，模型預測值偏差6.9%，與理論值較為一致。因此，認為利用響應面分析法得到的優化提取工藝參數準確可靠，得到的提取條件具有一定的實際應用價值。

2.3 最佳工藝提取液的抗氧化活性的測定

對采用最佳工藝所得提取液進行抗氧化活性測定。如圖5所示，DPPH清除率76.2%、羥自由基清除率52.96%、鐵氰化鉀還原力(實際吸光度)為0.289、銅離子還原力相當于1.888mg(trolox等同量)/g、而金屬螯合率為21.43%，說明大蒜鱗莖提取液具有很好的抗氧化活性。

圖 5 總酚提取量及抗氧化活性指標Fig.5 Total phenolic content extracted under optimized extraction conditions and antioxidant activity

3 結 論

通過單因素試驗和 Box-Behnken中心組合設計原理以及響應面分析法對大蒜中總酚類物質的提取工藝進行優化，得到料液比、提取時間、不同體積分數提取劑3個因素與總酚提取量的回歸模型，經檢驗證明該模型合理可靠，能較好地預測大蒜中總酚提取量。由該模型確定的最優工藝條件為料液比1:14(g/mL)、提取時間31min、提取劑為80%酸化甲醇，在此條件下，得到總酚提取量為0.67mg GAE/g，與理論值0.72mg GAE/g較為一致。同時，抗氧化活性試驗結果表明大蒜具有很好的抗氧化活性。

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Response Surface Methodology for Optimization of Extraction Conditions of Total Phenolic Compounds from Garlic and Determination of Antioxidant Activity

DU Jun-na，CHEN Shu-xia*，CHENG Zhi-hui，CHANG Yan-xia，ZHOU Jing
(Key Laboratory of Horticultural Plant Germplasm Resources Utilization in Northwest China, Ministry of Agriculture,College of Horticultural Science, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

Response Surface Methodology (RSM) was used to optimize extraction parameters (including material/liquid ratio,extraction time and concentration of extracting agents) so as to achieve the maximum extraction yield of total phenolic compounds.Studies were carried out on the respective independent variables (material/liquid ratio, extraction time and concentration of extracting agents) and the interactive effects of these three factors on the total phenolic compounds according to Box-Benhnken design. A mathematical quadratic polynomial regression equation reflecting the relationship between the total phenolic compounds and the above extraction parameters was established. The optimal extraction parameters were obtained as: material/liquid ratio 1:14 (g/mL) , extraction time 31 min, and 80% acidification methanol as extracting agent. Under the optimal condition,the total phenolic content was 0.67 mg GAE/g, and the model prediction deviation was 6.9%. Meanwhile, the antioxidant activity was determined with five different methods, and the results showed that garlic had good antioxidant activity.

garlic；total phenolic compounds；antioxidant activity；response surface methodology

S663.4

A

1002-6630(2012)10-0072-06

2011-05-21

西北農林科技大學唐仲英育種基金項目(A212020911)；西北農林科技大學青年學術骨干支持計劃項目(01140303)；國家公益性行業(農業)科研專項(200903018-7)

杜俊娜(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為蔬菜生理與分子育種。E-mail：dujunna2005@126.com

*通信作者：陳書霞(1971—)，女，副教授，博士，研究方向為蔬菜生理與分子育種。E-mail：shuxiachen@nwsuaf.edu.cn