兩種來源酶多種方式水解牛骨蛋白

萬婷婷，羅愛平,*，何光中，李 麗，陳 明

(1.貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省畜牧獸醫科學研究所，貴州 貴陽 550000)

兩種來源酶多種方式水解牛骨蛋白

萬婷婷1，羅愛平1,*，何光中2，李 麗1，陳 明1

(1.貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省畜牧獸醫科學研究所，貴州 貴陽 550000)

選用兩種不同來源的枯草桿菌中性蛋白酶與木瓜蛋白酶，以水解度為特征性指標，采用5種不同水解方式水解牛骨蛋白。結果表明：枯草桿菌中性蛋白酶與木瓜蛋白酶同步水解，效果優于木瓜蛋白酶與枯草桿菌中性蛋白酶分步水解兩種方式，最佳酶體系反應條件為pH7.05、溫度51℃、加酶總量7000U/g(枯草桿菌中性蛋白酶與木瓜蛋白酶用量比1∶1)、150r/min 振蕩水解6h，水解度可達27.54%。

牛骨蛋白；水解；木瓜蛋白酶；枯草桿菌中性蛋白酶；水解度

我國蛋白質資源緊缺，大力開發和合理利用蛋白質資源顯得非常必要。目前，蛋白質水解主要有酸法、堿法和酶法[1]。酸、堿法由于條件苛刻而趨于淘汰，酶法具有定向、易控、溫和等優點，因此，現在較多采用酶法。

蛋白酶按其來源分為植物蛋白酶、動物蛋白酶及微生物蛋白酶3類[2]。綜合考慮酶的來源、價格、水解效果及反應條件[3]，試驗選用木瓜蛋白酶與枯草桿菌中性蛋白酶。木瓜蛋白酶可作用于蛋白質中的甘氨酸及賴氨酸等殘基參與形成的肽鍵，枯草桿菌中性蛋白酶專一性廣泛，肽鍵的一側含有疏水性氨基酸的肽鍵均可被其水解[4]。

單一酶的作用范圍小，水解度不高，所得的酶解產物多為多肽，且分子質量較大[5]。利用不同性質不同水解位點的兩種或兩種以上酶水解，根據水解底物的方式不同實現對底物的深度水解。枯草桿菌中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的反應條件相當，兩者的最適pH值接近中性，且兩種酶的專一性底物又具有一定的互補性。

本研究以牛骨粉為水解反應底物，選擇植物蛋白酶與微生物蛋白酶兩種不同來源的酶，采用不同水解方式水解牛骨蛋白，以期達到較高的水解度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛骨粉(粒度200目)為貴州大學動物性食品綜合實驗室自制[6]。

枯草桿菌中性蛋白酶(10萬U/g)、木瓜蛋白酶(10萬U/g) 南寧龐博生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

LD4-2型離心機 北京醫用離心機廠；HI98128型pH計 北京惠通卓越科技發展有限公司；FW-80型高速萬能粉碎機 東莞市創瑞工業試驗設備有限公司；THZ-98A恒溫振蕩培養箱 上海一恒科技有限公司；YX-28OB型蒸汽滅菌鍋 上海三申醫療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛骨蛋白水解工藝

工藝流程：牛骨粉→加水→調節pH值→水解→滅酶→冷卻→離心→取上清液→測定水解度及氮收率。

操作要點：牛骨粉加適量蒸餾水充分混勻后，按照設計方案置恒溫振蕩培養箱150r/min 振蕩水解，水解完畢后于85～90℃滅酶10min，冷卻至常溫，4000r/min離心10min，取上清液測定水解度及氮收率。

1.3.2 牛骨蛋白水解體系條件優化

1.3.2.1 水解方式確定

固定牛骨粉質量分數10%[7]、pH7、水解溫度50℃、加酶總量4000U/g、枯草桿菌中性蛋白酶與木瓜蛋白酶復合水解時的酶用量比1∶1為酶反應體系，以水解度和氮收率為指標，研究不同水解方式對目標值的影響。分別選取5種水解方式：Ⅰ：木瓜蛋白酶單酶振蕩水解6h；Ⅱ：枯草桿菌中性蛋白酶單酶振蕩水解6h；Ⅲ：枯草桿菌中性蛋白酶先振蕩水解3h滅酶后，加入木瓜蛋白酶振蕩水解3h；Ⅳ：木瓜蛋白酶先振蕩水解3h滅酶后，加入枯草桿菌中性蛋白酶振蕩水解3h；Ⅴ：枯草桿菌中性蛋白酶與木瓜蛋白酶同時振蕩水解6h。確定最佳水解方式。

1.3.2.2 水解時間的確定

在酶反應體系及評價指標不變的條件下，設定水解時間分別為4、5、6、7、8h，確定最適宜的水解時間。

1.3.2.3 枯草桿菌中性蛋白酶與木瓜蛋白酶用量比的確定

設定枯草桿菌中性蛋白酶與木瓜蛋白酶用量比為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3(m/m)，在其他酶反應體系及評價指標不變的條件下，振蕩水解6h。確定最佳酶用量比。

1.3.2.4 二次正交旋轉組合試驗設計

在單因素試驗基礎上，根據Box-Behnken中心組合設計原理[8-10]，以水解度為響應值，設計三因素三水平二次正交旋轉組合試驗，對牛骨蛋白水解體系條件進行優化。

1.3.3 指標測定

水分測定：參照GB 5009.3—2010《食品中水分的測定：直接干燥法》；灰分測定：參照GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定：灼燒稱重法》；脂肪測定：參照GB/T 22223—2008《食品中脂肪的測定：索氏抽提法》；蛋白質、總氮量測定：參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定：微量凱氏定氮法》；鈣測定：參照GB/T9695.13—2009《食品中鈣的測定：高錳酸鉀滴定法》；游離氨基氮測定：參照GB/T5009.39—2003《醬油衛生標準的分析方法：甲醛電位滴定法》；pH值測定：采用pH測定儀測定；水解度測定：參照文獻[11]方法；氮收率的測定：參照文獻[12]方法。

1.3.4 數據處理

每組數據平行測定3次，采用Design Expert 7.1.6軟件進行響應面設計，并對數據分析處理。

2 結果與分析

2.1 原料基本成分

表1 牛骨及牛骨粉的基本營養成分Table 1 Basic nutritional components in bovine bone and bone powder

將新鮮牛骨制備成牛骨粉，蛋白質暴露面積增加，有利于其水解。由表1可知，原料牛骨經處理加工為牛骨粉后，蛋白質占總量的23.30%，表明試驗用的底物蛋白質含量高。

2.2 不同水解方式水解牛骨蛋白的結果

表2 不同水解方式水解牛骨蛋白結果Table 2 Effect of dual-enzyme hydrolysis method on the degree of hydrolysis

衡量蛋白質的水解效果常用兩個指標，即氮收率與水解度。氮收率一般用水解后得到的可溶性氮占總氮的比例表示，水解度是基于蛋白質被裂解的肽鍵數目來衡量水解效果[13]。由表2可知，Ⅴ組的水解度與氮收率分別為18.69%、65.62%，比Ⅲ組分別提高5.06%、5.75%，差異顯著(P＜0.05)。比Ⅳ組分別提高12.73%、9.11%，差異顯著(P＜0.05)。同步水解期間不需加熱滅酶，操作簡單，在實際生產中可操作性強。從實際生產和發揮兩種酶最大活力考慮，確定Ⅴ組即枯草桿菌中性蛋白酶與木瓜蛋白酶同步水解的方式水解牛骨蛋白。

Ⅴ組的水解度與氮收率比Ⅰ組分別提高45.79%、37.34%，差異顯著(P＜0.05)，比Ⅱ組分別提高18.07%、12.88%，差異顯著(P＜0.05)，故利用兩種酶不同水解位點的性質可提高牛骨蛋白的水解度。

2.3 水解時間對牛骨蛋白水解效果的影響由圖1可知，水解度與氮收率在4～6h呈上升趨勢，分別達18.69%、73.06%，在6～8h其值趨于平緩。反應時間過長，增加經濟成本，因美拉德反應會影響酶解物的外觀顏色，還會產生一些短肽類的苦味物質[14-17]。綜合考慮酶解時間以6h為宜。

2.4 枯草桿菌中性蛋白酶與木瓜蛋白酶用量比對牛骨蛋白水解效果的影響

圖2 枯草桿菌中性蛋白與木瓜蛋白酶用量比對水解效果的影響Fig.2 Effect of papain-neutral protease ratio on hydrolysis efficiency

由圖2可知，隨著枯草桿菌中性蛋白酶與木瓜蛋白酶用量比的變化，氮收率呈先上升后下降的趨勢，而水解度變化平緩，其機理有待進一步研究。枯草桿菌中性蛋白酶與木瓜蛋白酶用量比為1∶1時，氮收率與水解度均達最大值，分別為73.06%、18.69%。故確定枯草桿菌中性蛋白酶與木瓜蛋白酶用量比為1∶1。

2.5 二次正交旋轉組合試驗設計優化兩種酶同步水解牛骨蛋白工藝條件

氮收率一般用水解后得到的可溶性氮占總氮的比例表示，由于蛋白質水解到一定程度后肽分子在水中已經得到很好的溶解，更大程度的水解不會從氮收率上進一步表現，所以對于水解程度較大的產物不能反映實際水解情況。水解度是從蛋白質水解時斷裂的肽鍵數上來定義蛋白質水解程度，所以水解度可以最準確地反映出蛋白質水解程度的大小[13]，故以水解度為響應值，優化兩種酶同步水解牛骨蛋白的體系條件，因素水平設計見表3，結果見表4。

表3 兩種酶同步水解牛骨蛋白二次正交旋轉組合試驗設計因素水平表Table 3 Factors and levels of orthogonal tests for optimizing dual-enzyme hydrolysis process

表4 兩種酶同步水解牛骨蛋白二次正交旋轉組合試驗結果Table 4 Design and results of orthogonal tests for optimizing dual-enzyme hydrolysis process

采用Design Expert 7.1.6軟件對表4數據進行二次多項式回歸擬合，得到二次多元回歸方程：Y＝24.99＋4.22A＋2.34B＋1.35C－0.43AB－ 0.45AC－0.31BC－1.63A2－8.55B2－2.60C2。結果方程分析見表5。

表5 二次正交旋轉組合試驗回歸分析表Table 5 Variance analysis for the regression model

由表5可知，模型極顯著(P＝0.0002)，失擬項不顯著，表明回歸方程與實際數據之間具有非常好的擬合性。方程中A、B的P值均小于0.05，表明酶用量、pH值對水解度影響顯著，溫度對水解度影響不顯著，其中加酶總量影響最大，pH值影響次之，溫度對水解度影響最小。交互項對水解度影響均不顯著，pH值及溫度的二次項對水解度影響顯著。

圖3中每個響應面分別代表著兩個獨立變量之間的相互作用，此時另外兩個變量保持在最佳水平。

圖3 各兩因素交互作用的響應面及等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots for the effects of crossinteractions among factors on hydrolysis efficiency

由圖3a可知，水解度隨pH值的升高和加酶總量的增加呈先上升后下降的趨勢。因為酶對底物pH值比較敏感，pH值過高或過低都會降低酶解效果。由圖3b可知，水解度隨溫度的升高和加酶總量的增加呈先上升后下降的趨勢。加酶總量過高時，由于酶本身的相互水解作用加強，會阻礙酶對底物的酶解[18]。由圖3c可知，水解度隨pH值和溫度的升高呈先上升后下降的趨勢。溫度是影響酶活力的重要因素之一，溫度過高或過低均影響酶活力。

極值條件應在等高線的橢圓圓心處[19]。為得到水解度最佳條件，令回歸方程一階偏倒數等于零，整理得到方程組，解方程組即為3因素的最佳水平代碼值，即加酶總量7000U/g、pH7.05、溫度50.83℃。計算結果表明加酶量、pH值及溫度均在試驗設計范圍內。考慮生產實際及應用方便，校正溫度51℃。按最佳條件進行3次驗證實驗，水解度的平均值為27.54%，比理論值27.76%低0.79%。比吳敏等[14]報道水解度18.34%提高50.16%，可能與選擇酶的種類及試驗設計方法有關。

3 結 論

3.1 采用枯草桿菌中性蛋白酶與木瓜蛋白酶同步水解，其水解效果優于先木瓜蛋白酶后枯草桿菌中性蛋白酶及先枯草桿菌中性蛋白酶后木瓜蛋白酶。蛋白質水解度分別為18.69%、17.79%、16.31%，差異顯著(P＜0.05)。

3.2 兩種酶同步水解的水解度與氮收率分別為18.69%、65.62%，比枯草桿菌中性蛋白酶單酶水解分別提高18.07%、12.88%，差異顯著(P＜0.05)，比木瓜蛋白酶單酶水解分別提高45.79%、37.34%，差異顯著(P＜0.05)。故利用兩種酶不同水解位點的性質可提高牛骨蛋白的水解度。

3.3 采用二次正交旋轉組合試驗設計優化水解牛骨蛋白最佳酶解體系反應條件為pH7.05、溫度51℃、酶總量7000U/g(枯草桿菌中性蛋白酶與木瓜蛋白酶酶用量比1∶1)，在150r/min振蕩水解6h，水解度可達27.54%。

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Dual-enzyme Hydrolysis of Bovine Bone Protein Using Different Methods

WAN Ting-ting1，LUO Ai-ping1,*，HE Guang-zhong2，LI Li1，CHEN Ming1
(1. College of Life Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China；
2. Animal Husbandry and Veterinary Science Institute of Guizhou Province, Guiyang 550000, China)

Two proteases includingBacillussubtilis neutral protease and papain are used to hydrolyze bovine bone protein by five hydrolysis methods. The optimal dual-enzyme hydrolysis conditions of bone protein were explored for maximizing hydrolysis efficiency. The results indicated that synchronous hydrolysis of bone protein exhibited a higher hydrolysis efficiency when compared with the sequential hydrolysis by papain first and thenBacillusprotease orBacillusprotease first and then papain. The optimal hydrolysis conditions were total enzyme amount of 7000 U/g at papain-neutral protease ratio of 1∶1,oscillation hydrolysis time of 6 h, oscillation speed of 150 r/min, hydrolysis temperature of 51 ℃, hydrolysis pH of 7.05 and substrate concentration of 10%. Under the optimal hydrolysis conditions, the degree of hydrolysis was up to 27.54%.

bone protein；hydrolysis；Bacillusprotease；papain；degree of hydrolysis

TS251.2

A

1002-6630(2012)10-0119-05

2011-04-27

貴州省科技廳資助項目(黔科合NY字[2007]3021號)；貴州省農業委員會資助項目(GZCYTX-0301-03)；貴州大學研究生創新基金項目(校研農2011021)

萬婷婷(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為藥食資源利用。E-mail：wan_tingting_hi@126.com ；

*通信作者：羅愛平(1958—)，女，教授，學士，研究方向為畜產品加工。E-mail：luoaiping58@126.com