響應(yīng)面分析法優(yōu)化當(dāng)歸多糖提取工藝

王艷艷，王團(tuán)結(jié)*，丁琳琳

(1.江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院連云港中醫(yī)藥分院，江蘇 連云港 222006；

2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001；3.天津紅日藥業(yè)股份有限公司，天津 301700)

WANG Yan-yan1，WANG Tuan-jie2,*，DING Lin-lin3

(1. Lianyungang Branch of Traditional Chinese Medicine, Jiangsu Union Technical Institute, Lianyungang 222006, China；

2. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co. Ltd., Lianyungang 222001, China；

3. Tianjin Chasesun Pharmaceutical Co. Ltd., Tianjin 301700, China)

響應(yīng)面分析法優(yōu)化當(dāng)歸多糖提取工藝

王艷艷1，王團(tuán)結(jié)2,*，丁琳琳3

(1.江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院連云港中醫(yī)藥分院，江蘇 連云港 222006；

2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001；3.天津紅日藥業(yè)股份有限公司，天津 301700)

目的：優(yōu)選當(dāng)歸多糖的提取工藝。方法：以當(dāng)歸多糖為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)響應(yīng)面分析法優(yōu)化當(dāng)歸多糖的提取工藝，并對(duì)最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：當(dāng)歸多糖的最佳提取工藝為每次提取時(shí)間2.15h、料液比1∶8.27(g/mL)、提取3次。結(jié)論：采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化對(duì)當(dāng)歸多糖提取條件進(jìn)行優(yōu)化合理可行。

響應(yīng)面；當(dāng)歸；多糖；提取工藝

WANG Yan-yan1，WANG Tuan-jie2,*，DING Lin-lin3

(1. Lianyungang Branch of Traditional Chinese Medicine, Jiangsu Union Technical Institute, Lianyungang 222006, China；

2. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co. Ltd., Lianyungang 222001, China；

3. Tianjin Chasesun Pharmaceutical Co. Ltd., Tianjin 301700, China)

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

當(dāng)歸產(chǎn)自甘肅，烘干，備用；95%酒精、濃硫酸(95%～98%)、蒽酮均為分析純；雙蒸水(自制)。

UV-9600型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司；BC-R5001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海貝凱生物化工設(shè)備有限公司；HHS-1型電熱恒溫水浴鍋 上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；CT-C熱風(fēng)循環(huán)烘箱 南京千方臭氧設(shè)備廠；LD5-2A型離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；B3200S超聲清洗機(jī) 必能信超聲上海有限公司。

1.2 方法

1.2.1 多糖含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

稱(chēng)取50.00mg蒽酮用76%稀硫酸(76mL濃硫酸加入30mL水中)定容到50mL備用。稱(chēng)取105℃干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖25.00mg，加蒸餾水定容于25mL，配成1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL于25mL容量瓶中，加蒸餾水定容搖勻，再分別吸取各質(zhì)量濃度葡萄糖溶液1mL，加5mL蒽酮試液，立即放入冰水浴中搖勻后，置沸水浴中煮10min，取出用水沖洗2min冷卻，靜置10min后于波長(zhǎng)624nm處測(cè)定吸光度，以蒸餾水1.0mL作空白對(duì)照。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)做回歸處理，得回歸方程為y＝0.0047x＋0.0325，R＝0.9991，線性范圍20～120μg/mL。

1.2.2 當(dāng)歸多糖的提取方法[7-15]

面癱(PFP),即周?chē)悦嫔窠?jīng)炎,是臨床常見(jiàn)的多發(fā)性面部神經(jīng)病變,是莖乳孔內(nèi)急性非化膿性炎性病癥。臨床癥狀主要是蹙額力減弱、眼睛不能完全閉合、口角下垂等,對(duì)患者的生活造成很大影響。而難治性PFP是因多種療法治療效果差遷延(3個(gè)月以上)所致,是一種難治性病癥。穴位針刺是治療面癱常用方法,報(bào)道治愈率在60%~70%[1]。近年來(lái),NMES在臨床上逐步應(yīng)用開(kāi)來(lái),在改善中樞神經(jīng)功能和重塑周?chē)窠?jīng)功能方面效果確切。本文主要探討上述兩種方法治療難治性PFP的臨床效果,報(bào)告如下。

當(dāng)歸粉碎，過(guò)40目篩，稱(chēng)取5.0g當(dāng)歸至250mL圓底燒瓶，加100mL乙醇(80%)，于80℃水浴中加熱回流1.5h，抽濾，棄去濾液，得濾渣，至250mL圓底燒瓶，加入蒸餾水，于80℃水浴中加熱回流，濾液至250mL容量瓶中，定容，取4mL定容到100mL容量瓶中，用作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)吸光度，計(jì)算提取率。

1.2.3 樣品多糖含量及得率測(cè)定

按照1.2.1節(jié)方法測(cè)定其吸光度，計(jì)算樣品中多糖含量和樣品中多糖得率。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

分別以不同的提取時(shí)間(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h)，不同提取次數(shù)(1、2、3、4、5次)，選擇不同的料液比(1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10)為單因素，考察不同單因素對(duì)多糖得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)當(dāng)歸多糖得率有較顯著影響的3個(gè)因素，即提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)方案，因素及水平見(jiàn)表1。其中編碼值與真實(shí)值換算關(guān)系，提取時(shí)間X1＝(T－2)/0.5；料液比X2＝(V－40)/5(注：料液比1∶8時(shí)加液為40mL)；提取次數(shù)X3＝(n－2)/1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平編碼表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effect of extraction time on extraction yield of polysaccharide

圖1表明，提取時(shí)間在2h內(nèi)，多糖得率有所增加，但2h后多糖得率降低，因此將提取時(shí)間應(yīng)控制在2h左右。這種現(xiàn)象的發(fā)生提示在提取過(guò)程中提取時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)使多糖在高溫提取過(guò)程中的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，而使部分多糖破壞和降解，多糖得率降低，有待進(jìn)一步證實(shí)[16]。

圖2 提取次數(shù)對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effect of times of extraction on extraction yield of polysaccharide

圖2表明，提取次數(shù)為2次時(shí)，多糖得率較高，考慮到提取次數(shù)越多，消耗越大且濃縮時(shí)損耗也較大，因此選擇提取次數(shù)2次最佳。

圖3 料液比對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction yield of polysaccharide

圖3表明，不同料液比對(duì)得率多糖量的影響較大，料液比在1∶8時(shí)，多糖得率最高[17]。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

采用表1設(shè)置的三因素三水平，根據(jù)測(cè)得的正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)行12組試驗(yàn)，其中1～9是析因試驗(yàn)，10～12是中心試驗(yàn)，用來(lái)估計(jì)試驗(yàn)誤差。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 當(dāng)歸多糖提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Trials of response surface analysis and experimental results

經(jīng)Statistica 6.0響應(yīng)面分析后，其方差分析結(jié)果見(jiàn)表3，Pareto圖見(jiàn)圖4。

表3 當(dāng)歸多糖得率的全模型方差分析表Table 3 Analysis of variance of regression equation for extraction efficiency of Angelica sinensis polysaccharide

由表3可看出，除了料液比與提取次數(shù)的共同作用項(xiàng)的P＞0.05，其他各項(xiàng)P＜0.05，其中X12、X22、X1X3、X2X3影響顯著，X2、X3、X32、X1X2影響極顯著。回歸方程相關(guān)系數(shù)R＝0.99942，說(shuō)明響應(yīng)值的變化有99.942%來(lái)自于所選變量。由圖4可知，所選因素的影響次序?yàn)樘崛〈螖?shù)＞提取時(shí)間＞料液比。但是當(dāng)3個(gè)因素聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)得率的影響都比較顯著。

圖4 當(dāng)歸多糖提取回歸分析結(jié)果Fig.4 Analysis of variance of regression for extraction result of Angelica sinensis polysaccharide

2.2.2 當(dāng)歸多糖的提取最佳工藝條件確定

圖5 各兩因素交互作用對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface plots for the effects of cross-interaction on extraction yield of Angelica sinensis polysaccharide

表4 最優(yōu)值分析結(jié)果表Table 4 Analysis results of optimal value

由圖5及表4分析可知，當(dāng)歸多糖得率最優(yōu)值4.94%，X1＝0.297、X2＝0.273、X3＝0.880，計(jì)算得本試驗(yàn)各因素最優(yōu)值為提取時(shí)間2.15h、料液比1∶8.27(g/mL)、提取次數(shù) 2.88(即提取次數(shù)取3次。)

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取5.0g當(dāng)歸粉末用100mL的80%乙醇在80℃水浴中加熱提取1.5h，抽濾，棄去濾液，得濾渣；再用1∶8.27的蒸餾水量，在80℃條件下，提取2.15h，最后抽濾得濾液，重復(fù)提取3次，轉(zhuǎn)到250mL的容量瓶中，定容，取出4mL定容到100mL容量瓶，按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)其吸光度為0.402，即可算得提取率為4.91%。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了回流法提取當(dāng)歸中多糖工藝，考察提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)3個(gè)因素對(duì)當(dāng)歸多糖得率的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以提取率為指標(biāo)考察提取當(dāng)歸多糖的最佳提取工藝，各因素對(duì)提取率的影響為：提取次數(shù)＞提取時(shí)間＞料液比，其中提取次數(shù)是影響當(dāng)歸多糖提取的關(guān)鍵因素。最佳工藝條件為提取時(shí)間2.15h、料液比1∶8.27(g/mL)、提取次數(shù)3次，此時(shí)提出率可達(dá)4.91%。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得出的當(dāng)歸多糖提取工藝，可為開(kāi)發(fā)利用當(dāng)歸資源提供基礎(chǔ)。

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Optimization of Polysaccharide Extraction fromAngelica sinensisUsing Response Surface Methodology

Objective∶ To research the optimal extraction conditions of polysaccharide fromAngelica sinensis. Methods∶Response surface methodology (RSM) was applied to optimize the best extraction conditions, and then verified the optimal conditions. Results∶ The optimal conditions were as follows∶ the time for 2.15 h, solid-liquid ratio at 1∶8.27, and extraction times for 3 times. Conclusion∶ It is feasible to optimize the extraction processing of polysaccharide fromAngelica sinensisby RSM.

response surface methodology；Angelica sinensis；polysaccharide；extraction

R284.2

A

1002-6630(2012)10-0146-04

2011-04-18

王艷艷(1981—)，女，講師，碩士，研究方向?yàn)樗巹W(xué)、制藥設(shè)備、分析化學(xué)。E-mail：wyy8127@163.com

*通信作者：王團(tuán)結(jié)(1986—)，男，工程師，碩士，研究方向?yàn)橹兴幮?yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)。E-mail：union_wang@163.com