不同乳酸菌強化接種發酵辣椒揮發性風味成分分析

韓江雪，丁筑紅*，李仲軍，黃衛星

(貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

不同乳酸菌強化接種發酵辣椒揮發性風味成分分析

韓江雪，丁筑紅*，李仲軍，黃衛星

(貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025)

為更好地了解強化接種發酵對辣椒的風味特征影響，采用固相微萃取-氣相色譜-質譜技術檢測4株乳酸菌強化接種發酵辣椒風味成分。結果共檢出揮發性風味物質20類191種。不同菌種發酵樣品風味物質的種類及含量有較大差異，發酵乳桿菌共檢出揮發性風味物質15類76種，乳鏈球菌共檢出8類20種，植物乳桿菌共檢出13類84種，乳酸片球菌共檢出11類73種。經主成分分析方法統計顯示，發酵乳桿菌的風味物質綜合評分為11.28分、乳酸片球菌為3.65分，植物乳桿菌為－0.08分，乳酸鏈球菌為－11.30分，自然發酵為－3.56分。風味物質綜合排名為：發酵乳桿菌＞乳酸片球菌＞植物乳桿菌＞自然發酵＞乳鏈球菌，發酵乳桿菌、乳酸片球菌以及植物乳桿菌強化發酵較自然發酵辣椒風味品質突出。

乳酸菌；發酵辣椒；固相微萃取-氣相色譜-質譜；主成分分析

發酵辣椒是一種傳統的地方發酵蔬菜制品，在我國貴州、湖南、四川、重慶等地食用廣泛，是日常餐桌食品，深受人們喜愛。傳統的發酵辣椒是利用天然附著在辣椒表面的微生物(主要是乳酸菌)進行發酵，加上食鹽的高滲透作用抑制其大部分雜菌的生長，經發酵而制成[1]。隨著工業化生產及食品安全需求，人工接種乳酸菌發酵技術已有研究和應用嘗試，該技術在縮短發酵周期、提高安全品質方面取得良好效果[2]。

在外源菌種強化發酵中，由于菌種差異性可能導致發酵產品風味差異性，從而影響產品風味。本實驗在傳統發酵辣椒的基礎上，選用不同屬的乳酸菌進行強化接種，采用固相微萃取-氣相色譜-質譜法(solid phase micro-extraction-gas chromatograhy-mass spectrometry，SPME-GC-MS)提取樣品中的揮發性風味物質[3]，并對風味物質進行分析鑒定，旨在比較不同屬乳酸菌發酵后的風味特性，為生產中合理選用優良乳酸菌提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮辣椒：購于本地農貿市場。選用顏色鮮紅，無蟲蛀、無霉變、無損傷的新鮮辣椒。清水沖洗后備用。

蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、葡萄糖、乙酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫80、氯化鈉均為分析純。

發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、乳鏈球菌(Streptococcus lactis) 貴州輕化工中心；植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) 中國工業微生物菌種保藏管理中心。

HP6890/5975C氣相色譜質譜聯用儀 美國安捷倫公司；固相微萃取器(2cm-50/30μm DVB) 美國Supelco公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

將洗凈鮮辣椒去果柄，切成0.5cm×0.5cm的小塊，加入質量分數8%的氯化鈉溶液，攪拌均勻后裝入發酵瓶中。將活化好的乳酸菌按質量分數10%的接種量接入發酵瓶中。30℃發酵6d。

取發酵成熟的辣椒80g，裝入進樣瓶中加熱到60℃。將活化好的萃取頭插入進樣瓶，頂空萃取30min。

1.2.2 GC-MS操作條件

色譜柱：HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane(30m×0.25mm，0.25μm)彈性石英毛細管柱，柱溫45℃(保留0.5min)，以5℃/min升溫至290℃，保持2min；汽化室溫度250℃；載氣為高純He(99.999%)；柱前壓7.62psi，載氣流量1.0mL/min；分流比20:1。

離子源為電子轟擊電離源(electron impact，EI)；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70eV；發射電流34.6μA；倍增器電壓1037V；接口溫度280℃；質量范圍20～550u[4]。

1.2.3 數據分析

采用主成分分析方法(principal component analysis，PCA)。計算步驟如下：

原始指標數據的標準化采集，p維隨機向量x＝(x1,X2,…,XP)T n個樣品，xi＝(xi1,xi2,…,xip)T，i＝ 1,2,…,n，n＞p，構造樣本陣，對樣本陣元進行如下標準化變換：

2 結果與分析

2.1 不同乳酸菌發酵樣品總離子流圖

圖1 不同發酵方式辣椒揮發性風味物質的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of the volatile components in fermented chili by Streptococcus

由圖1可知，風味物質的出峰時間大部分集中在30min之前。各個樣品的最大峰度值差異較大，乳酸片球菌最大峰度為1 7 0 0 0 0，植物乳桿菌最大峰度為110000，發酵乳桿菌最大峰度為320000，乳鏈球菌最大峰度為340000，自然發酵樣品最大峰度為110000。可從總離子圖中得出強化接種的樣品在峰度值上有明顯的提高，自然發酵樣品的僅有兩個物質的峰值在60000以上，而強化接種的峰值大部分都在100000以上。說明接種對風味物質的強化有明顯作用。

4種菌種強化接種以及自然發酵辣椒揮發性風味物質經SPME-GC-MS分析后總共檢出18類136種。各樣品檢出情況如表1所示。

由表1可知，接種強化發酵的辣椒風味物質種類和數量上明顯優于與自然發酵辣椒，4種菌種中植物乳桿菌和發酵乳桿菌的醇類和醛類物質含量較高，乳酸片球菌酮類和酯類物質含量較高，乳鏈球菌的風味物質種類較少，數量也較低。周曉媛[6]等通過氣相色譜-質譜聯用儀對傳統發酵辣椒揮發性成分進行分離鑒定，共得到10類56種化合物，其中烴類最多有20種，其次是醇類有1 3種和酯類有8種，另外酚類、醛類、酮類、縮羰基類、酸類、吡嗪類和其他雜環類分別是1、3、4、1、3、1、2種。與本實驗結果比較，檢出的風味物質種類基本相同，在風味物質的數量上存在較小差異，原因與原料選擇、樣品發酵及處理方式、設備差異性等有關。

2.2 揮發性成分主成分變量選擇

2.2.1 主成分變量篩選

PCA法是一種將多維因子納入同一系統中進行定量化研究，理論比較完善的多元統計分析方法[7]，其基本思想是認為在眾多有相關性的因子之間必然存在著起支配作用的共同因子[8]。通過確定少數幾個主成分因子來表示原樣本中多個復雜的、規律難尋的變量，并根據主成分因子在不同樣本中貢獻率的大小，得到樣本問規律性與差異性的評價[9]。

通過2.1節的分析可知，共同檢出項包括乙醇、異丁醇、異戊醇、4-甲基-1-戊醇、正己醇、芳樟醇、2-甲基十三烷、γ-雪松烯、反式-β-羅勒烯、2-正戊基呋喃、2-甲氧基-3-異丁基吡嗪。所有檢出物質中相對含量在5%以上的有異戊醇、4-甲基-1-戊醇、芳樟醇、乙酸乙酯、乙醇、正己醇、2-甲基-1-丁醇、3-羥基-2-丁酮。烴類檢出種類最多，但這類物質中烷烴的香氣一般比較弱，在空氣中也易于氧化變質[10]，故風味特征不明顯。烯烴類閾值較低，加熱可以促進揮發，是辣椒中的主要呈味物質[11]。醇類的檢出量僅次于烴類，醇類化合物包括脂肪族醇、萜醇、芳香族醇等幾大類；脂肪族醇類的氣味，其規律是隨著物質的相對分子質量的增大，氣味從弱到強，然后又從強到弱；萜醇類香料大多屬花香、青果和蜜香香氣[12]。酯類化合物氣味濃郁，香氣持久，低分子質量的酯類一般具有芳香氣味或特定水果香味。醛類物質的香氣濃烈，多為果香及花香。酮類具有性質穩定，香味優異持久等特點[13]。呋喃類檢出量雖然較少，但多具有強烈氣味。酚類多有藥香及木香等。含氮類如吡嗪等，具有咖啡等香氣。由于發酵辣椒的風味是由多種物質相互作用形成的，所以采用峰面積作為半定量分析風味物質的依據。故選擇其中12個成分及類別作為主成分變量，以峰面積大小為標準進行主成分分析(表2)。

表 1 不同發酵方式樣品中檢出的風味物質類別及數量Table 1 Type and quantity of flavor compounds detected from different samples

表2 不同樣品中同類風味物質峰面積Table 2 Peak area of similar flavor in different samples

2.2.2 揮發性成分主成分分析

由特征值的累計百分率大于85%(表3)確定主成分個數，由此選擇主成分M＝3。最終得到主成分得分表并依據貢獻率計算綜合得分(表4)。

表3 主成分積累方差貢獻率Table 3 Accumulated variance contribution rate of principal component

表4 不同樣品綜合評分及排名Table 4 Composite score and ranking of different samples

依據綜合評分高低對樣品進行綜合排名。依次為：發酵乳桿菌＞乳酸片球菌＞植物乳桿菌＞空白＞乳鏈球菌。依據綜合評分，發酵乳桿菌，乳酸片球菌的風味較好。

發酵乳桿菌的風味成分中，芳樟醇、丁醛類、雪松烯、2-甲基十三烷、呋喃類、2-甲氧基-3-異丁基吡嗪的峰面積都屬于最高值。其中，芳樟醇具有花香、木香、柑橘香、漿果香、玫瑰香等[14]；丁醛類中，3-甲基丁醛稀釋后具有愉快的水果香氣，2-甲基丁醛具有果香、巧克力、堅果香、青香，正己醛具有青香、葉香、果香，(E)-2-庚烯醛具有油脂香，苯甲醛具有苦杏仁、櫻桃及堅果香氣，2-十一烯醛具有柑橘香、脂肪香、蠟香等；雪松烯具有香柏香、木香等；呋喃類中，2-正戊基呋喃具有豆香、泥土香及類似蔬菜的香韻；2-甲氧基-3-異丁基吡嗪具有胡椒、咖啡的香氣。這些主要成分相互作用，構成了發酵乳桿菌強化接種產生的感官信息。而對照樣品相對而言，僅酮類和酚類相對發酵乳桿菌含量較高，雖然含有大量的烷烴類物質，但是香氣較弱，其他揮發性物質的種類都較少并且含量較低。

乳酸片球菌的風味成分中，反式-β-羅勒烯的峰面積高達249556，具有青香、熱帶果香、萜香、木香；酮類物質含量也較高，3-羥基-2-丁酮峰面積為328282，具有甜香、奶香和脂肪的油膩氣息；2-庚酮具有香蕉、奶酪及輕微的藥香。

乳鏈球菌與對照相比，風味物質種類非常少，其中乙酸乙酯含量非常高，具有果香及酒樣味道，芳樟醇、烯烴類、醛類等具有優良風味特征的物質含量很低，對照中各個風味組分含量較均衡，風味特征融合較好。

3 結 論

經過SPME-GC-MS分析揮發性風味物質，采用主成分分析方法，最終得到不同菌種發酵辣椒風味特征的綜合排名為，發酵乳桿菌＞乳酸片球菌＞植物乳桿菌＞自然發酵＞乳鏈球菌。與自然發酵相比較，風味物質在種類上差別不大，但是在種類和含量上有較大差別，強化接種可以提高發酵辣椒的優良風味特性。結果顯示發酵乳桿菌、乳酸片球菌適宜強化接種發酵，為自然發酵辣椒增加了醛類、醇類和酯類等有益的風味物質；植物乳桿菌強化發酵特點不明顯，乳鏈球菌在辣椒中的發酵特性表現不佳。

乳酸菌在發酵辣椒制作過程中對風味物質的呈現發揮了重要的作用，不同的乳酸菌產生的風味物質的種類及含量有較大區別。強化接種發酵可以有效提高產品風味品質。吳元鋒[15]等人通過分析接入不同乳酸菌和自然發酵泡菜過程中各項指標的變化，發現人工接入混合菌種泡菜風味較好，是一種較好的低鹽度泡菜生產方法。強化接種的發酵辣椒與未接種自然發酵的辣椒相比較，揮發性風味物質的類型沒有改變，但含量及組分分布上有較大改變，在醇類、醛類、烯烴類的含量變化上尤為明顯。科學選用外源菌種，采用強化接種的方式提高發酵辣椒的綜合品質特性是可行的。

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Volatile Analysis of Chili Fermented by DifferentLactobacillusSpecies

HAN Jiang-xue，DING Zhu-hong*，LI Zhong-jun，HUANG Wei-xing

(College of Life Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

To better understand the effect of artificial inoculation on the flavor characteristics of fermented chili, SPME-GCMS was used to analyze the flavor composition of different types of fermented chili (natural fermentation and inoculated fermentation with 4 differentLactobacillusspecies). A total of 191 volatile flavor compounds were found belonging to 20 categories. Chili fermented by different strains contained very different types and amounts of volatile flavor compounds.Seventy-six flavor compounds (15 categories) were found inLactobacillus fermentumfermented chili, 20 (8 categories) in Streptococcus lactis fermented chili, 84 (13 categories) inLactobacillus plantarum, and 73 (11 categories) in Pediococcus acidilactici fermented chili. The results of principal component analysis (PCA) indicated that the comprehensive scores for volatile flavor compounds in chilis fermented by inoculation ofLactobacillus fermentum,Pediococcus acidilactici,Lactobacillus plantarumorStreptococcus lactisor naturally fermented were 11.28, 3.65,－ 0.08, － 11.30 and － 3.56, respectively. Five kinds of chili could be ranked in decreasing order of comprehensive score for volatile flavor compounds as follows:Lactobacillus fermentum>Pediococcus acidilactici＞Lactobacillus plantarum＞natural fermentation＞Streptococcus lactis. Fermented chili prepared by artificial inoculation had more outstanding flavor quality than naturally fermented chili.

Lactobacillus；fermented chili；solid phase micro-extraction-gas chromatograhy-mass spectrometry (SPMEGC-MS)；principal component analysis (PCA)

TS207.3

A

1002-6630(2012)10-0179-05

2011-05-17

多功能生物菌劑制備及其在發酵辣椒生產中應用研究項目([2010]筑科農合同字第1-農-19號)；

貴州省科學技術基金項目(黔科合J字[2011]2156號)

韓江雪(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為食品加工與貯運保鮮技術。E-mail：hjxbjc@sohu.com

*通信作者：丁筑紅(1966—)，女，教授，學士，研究方向為農產品加工與綜合利用。E-mail：gzdxdzh@163.com