Chelex法結合環介導間接聚合酶鏈式反應檢測肉制品單增李斯特菌

鄭 鳴，邊傳周，劉仲敏

(1.鄭州牧業工程高等?？茖W校，河南 鄭州 450011；2.河南省科學院生物研究所有限責任公司，河南 鄭州 450008)

Chelex法結合環介導間接聚合酶鏈式反應檢測肉制品單增李斯特菌

鄭 鳴1，邊傳周1，劉仲敏2

(1.鄭州牧業工程高等專科學校，河南 鄭州 450011；2.河南省科學院生物研究所有限責任公司，河南 鄭州 450008)

目的：建立肉制品中單增李斯特菌環介導間接聚合酶鏈式反應檢測體系，實現快速檢測。方法：采用Chelex法從肉制品中分離模板DNA，根據單增李斯特菌hlyA基因的保守區設計兩條探針，將探針標記于報告基因(大豆Lectin基因)的兩端，此標記的報告基因與待測靶基因經雜交、缺口補平、環化后，采用反向聚合酶鏈式反應擴增報告基因，實現對靶基因的檢測。結果：該檢測體系檢出限低于100CFU/g(mL)，且與其他食源性致病菌的檢測無明顯交叉反應，對200份肉制品進行檢測，陽性率為2.5%，與傳統細菌分離檢測結果完全相符。結論：環介導間接聚合酶鏈式反應可以快速、靈敏、特異檢測肉制品中單增李斯特菌污染。

環介導間接聚合酶鏈式反應；肉制品；單增李斯特菌

單增李斯特菌是常見的食源性致病菌，可引起食源性李斯特菌病，致死率高達30%以上[1-4]，被列為21世紀對我國人民衛生健康具有重大影響的12種病源微生物之一。自從單增李斯特菌引起的食品中毒事件被首次確認以來[5-6]，人們就致力于對其檢測方法的研究[7-9]。傳統分離培養和鑒定技術需要1～2周時間，人力物力花費大，不適宜實際檢驗工作的需要，因此單增李斯特菌的檢測需要更靈敏、簡便的分子生物學檢測技術。本實驗在傳統聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)基礎上建立一種全新的PCR檢測技術，即環介導環間接PCR，旨在建立一種快速、準確檢測食品中單增李斯特菌的方法，以提高對細菌性食物中毒突發公共衛生事件快速反應能力及加入WTO對外食品貿易發展的新需要。其基本原理(圖1)是：將兩段相鄰的特異性探針分別連接在一段無關的報告基因首尾兩端，帶探針的報告基因可通過首尾探針序列與待測模板互補雜交，從而使其首尾末端靠近，雜交體單鏈缺口經DNA聚合酶補平、耐熱連接酶修復封閉，使報告基因DNA成環；再采用報告基因中間的序列為引物，反向擴增含探針的環狀報告基因而實現對病原菌的間接檢測。

圖1 環介導間接PCR基本實驗原理Fig.1 Principle of loop-mediated indirect PCR

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮豬肉、鮮牛奶 鄭州市購；單增李斯特菌標準株 中國食品藥品檢定研究院；單增李斯特菌分離株、腸毒性大腸埃希菌分離株、沙門氏菌分離株、大腸埃希氏菌O157∶H7分離株、志賀氏菌分離株和霍亂弧菌分離株 河南省科學院生物研究所微生物保藏中心(分離鑒定并保存)，質粒pMD18-T- Lectin和大腸桿菌JM109則由本實驗室保存。

Chelex-100 resin 美國bio-rad公司；ExTaq美國Takara公司；TSBYE 北京經科宏達生物公司；引物的合成有上海生工生物工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養及計數

將霍亂弧茵則接種于堿性蛋白胨溶液(含蛋白胨5mg/mL，NaCl 10mg/mL、pH8.3)中，單增李斯特菌標準株、分離株及其他菌種均接種于TSBYE，37℃搖床培養過夜。取單增李斯特菌標準株培養液1mL，用無菌生理鹽水進行10倍梯度稀釋，涂布于TSA平板，37℃培養24h后計數。

1.2.2 人工污染樣品的制備

采集市售鮮豬肉25g和鮮牛奶25mL(污染前利用傳統培養法檢測證實不含單增李斯特菌)，加入無菌生理鹽水至250mL，勻漿后加入單增李斯特菌標準株培養液，污染程度依次為 10-1、1、101、102、103、104、105CFU/mL，形成人工污染的樣品。

1.2.3 模板DNA的制備

取5mL細菌培養液，12000×g離心5min棄上清液，沉淀中加入6% Chelex-100 resin 56℃水浴20min，旋渦振蕩2min，煮沸8min，旋渦振蕩2min后立即置冰上冷卻5min，14000×g、4℃離心5min，上清液用作PCR模板；對于人工污染的肉制品勻漿液，取5mL樣品，先經22μm的膜過濾，收集濾液進行下步的模板DNA制備操作。

1.2.4 環介導間接PCR擴增體系建立

1.2.4.1 報告基因的制備

采用常規PCR以質粒pMD18-T-Lectin為模板擴增大豆Lectin基因片段用作檢測的報告基因，所用引物的5′端進行磷酸化修飾，上游引物序列：GGAATGGTGGAGAA CGGTAATTCAAGAAGCCTCATCACA；下游引物序列：GATGGACGATGTGAAATGAGCTTTCACCAGGGTTT AGTT，其中斜體部分為特異性探針，PCR反應體系總體積50μL，其中引物10pmol、dNTPs 0.25mmol/L、MgCl21.5mmol/L、質粒DNA模板1μL；Taq酶1.5U。擴增程序95℃預變性5min后，按下列程序擴增35個循環，95℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s。PCR產物用1.2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，同時進行膠回收純化特異性探針耦聯的報告基因。

1.2.4.2 報告基因環化及反向PCR

取單增李斯特菌標準株DNA溶液和制備好的特異性探針耦聯的報告基因進行報告基因環化及反向PCR擴增，用于反向PCR擴增的引物為報告基因中間序列，P1：TATC CGG CGTGGTAAACT；P2：CCTCCAACCATGAAACTT，反應體系為30μL，其中引物10pmol，dNTPs 0.3mmol/L，10×TaqDNA Ligase Reaction Buffer 3μL，10×ExTaqBuffer 3μL，TaqDNA Ligase 0.3μL，Ex Taq 0.20μL，報告基因和標準株DNA溶液各3μL。反應分3步進行：首先，進行95℃變性5min；之后按95℃ 50s、60℃ 8min進行5個循環；最后按95℃ 30s、52℃ 30s、72℃ 30s進行25個循環，PCR結束后立即進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并進行PCR產物克隆測序，序列測定由上海生工生物工程公司完成。

1.2.5 環介導間接PCR檢測體系的評估

特異性實驗：以制備的各種菌株的DNA作為模板進行環介導間接PCR檢測，PCR反應體系及反應條件同1.2.4.2節，PCR產物用1.2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，并進行T/A克隆，序列測定由上海生工生物工程公司完成。

敏感性實驗：取單增李斯特菌標準株培養液，用無菌生理鹽水稀釋成 101、102、103、104、105、106、107、108CFU/mL，然后采用Chelex法制備模板DNA，進行環介導間接PCR反應，檢測反應的靈敏度。

人工污染樣品的環介導間接PCR檢測：將上述不同污染程度的鮮肉和牛奶樣品采用Chelex法進行模板DNA制備，進行環介導間接PCR擴增，PCR反應體系及反應條件同1.2.4.2節。

1.2.6 環介導間接PCR檢測應用

將200份肉制品樣品各25g進行環介導間接PCR檢測和傳統微生物檢測，比較二者之間的符合率。

2 結果與分析

2.1 環介導間接PCR擴增體系的建立

2.1.1 報告基因的標記

以pMD18-T-Lectin質粒作為模板進行PCR擴增，電泳檢測發現，在250～500bp之間可見一清晰條帶(圖2)，與378bp的預期片段大小相符，將此片段回收進行克隆測序，結果發現兩端為特異性探針序列，中間序列為大豆Lectin基因片段(圖3)，由此說明特異性探針耦聯的報告基因制備成功。

圖2 報告基因的標記Fig.2 Label result of reporter gene

圖3 標記的報告基因序列Fig.3 Sequence of the labeled reporter gene

2.1.2 報告基因環化及反向PCR

單增李斯特菌標準株的DNA與報告基因的DNA經過雜交、修復、連接環化及反向PCR擴增后，電泳結果發現在500bp附近有一清晰條帶(圖4)，與預計的PCR產物440bp大小相符，將該PCR產物進行測序分析，結果顯示該PCR產物兩端為大豆Lectin基因片段，而中間為單增李斯特菌hlyA基因片段，與設想完全一致，由此可說明該方法可行。

圖4 報告基因的反向PCR擴增結果Fig.4 Reverser PCR result of the reporter gene

2.2 環介導間接PCR擴增體系的評估

2.2.1 特異性實驗

以不同菌株的DNA作為模板進行環介導間接PCR擴增，瓊脂糖電泳檢測，結果如圖5所示，單增李斯特菌標準株及分離株在500bp處均有特異性擴增片段，與440bp的預期片段相符，而其他非單增李斯特菌則檢測不到特異性擴增片段，將該片段進行測序分析，結果顯示該PCR產物兩端為大豆Lectin基因片段，而中間為單增李斯特菌hlyA基因片段，與設想完全一致。由此說明該方法特異性較高，符合實驗要求。

圖5 環介導間接PCR特異性分析Fig.5 Specificity analysis result of loop-mediated indirect PCR

2.2.2 敏感性實驗

用Chelex法從單增李斯特菌標準株培養液不同濃度稀釋液制備的模板DNA，進行環介導間接PCR擴增檢測，結果菌液濃度為10CFU/mL時仍然可以檢測到目的片段(圖6)，因此環介導間接PCR對單增李斯特菌的靈敏度可達到10CFU/mL。

圖6 環介導間接PCR敏感性分析Fig.6 Sensitivity analysis result of loop-mediated indirect PCR

2.2.3 人工污染樣品的PCR檢測

按照1.2.4節的方法，用Chelex法直接從污染樣品中分離DNA，進行環介導間接PCR檢測，用1.2g/100mL的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖7所示，人工污染的鮮肉和牛奶檢測的靈敏度均為10CFU/mL，與純菌懸液檢測的靈敏度相當，通過計算可知該方法對鮮肉制品和牛奶制品檢測的靈敏度可達100CFU/g(mL)。

圖7 人工污染樣品的環介導間接PCR檢測結果Fig.7 Detection result of the artificially contaminated samples by the loop-mediated indirect PCR

2.3 環介導間接PCR檢測應用

將采購的200份不同肉制品進行單增李斯特菌環介導間接PCR檢測，共檢測出陽性樣本5份，陽性率為2.5%，環介導間接PCR檢測結果采取傳統的培養法進行驗證，結果完全一致，兩種方法檢測的符合率為100%，結果見表1。

表1 各種肉制品檢測結果Table 1 Detection result of meat products

3 討 論

本實驗通過一步鏈置換反應，將靶基因的檢測轉換為報告基因的檢測，由于用到的報告基因為大豆Lectin基因，其與各種食源性致病菌遺傳背景差異大，避免了因污染而導致的假陰性和假陽性，擴增背景單一，與腸毒性大腸埃希菌、沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157∶H7、志賀氏菌和霍亂弧菌等食源性微生物的檢測無交叉反應，特異性好。另外，由于各種肉制品成分復雜，且含有較強的PCR擴增強抑制因子，使得PCR檢測單增李斯特菌靈敏度受樣本影響大[10-11]，為了獲得理想而穩定的檢測靈敏度，文獻報道的各種PCR檢測方法均需要對樣品進行增菌[12-13]，檢測時間長。本實驗采用Chelex結合膜過濾分離模板DNA，Chelex-100是一種離子交換樹脂，可螯合金屬離子，防止高溫對DNA損傷，在堿性和煮沸條件下促使DNA從細胞中釋放出來，從而達到既可保護DNA又能減少PCR擴增抑制因子的目的，提高了PCR檢測靈敏度。在不增菌的情況下，利用該技術對模擬的鮮肉和牛奶樣品檢測靈敏度與純菌液檢測靈敏度無異，均低于10CFU/mL，對應于鮮肉制品和牛奶制品檢測的靈敏度為100CFU/g(mL)，符合國際上對食源性單增李斯特菌的檢測要求，在保證檢測靈敏度的基礎上縮短了檢測時間；對送檢的200份肉制品進行檢測，檢出陽性樣本5份，與傳統方法檢測結果一致，但工作量大幅降低，實現了對單增李斯特菌特異、靈敏和快速檢測，為致病菌的快速排查，防止受到污染的食品擴散，阻止可能的單增李斯特菌爆發性流行提供了可靠的保證。

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Detection ofL. monocytogenein Meat Products Using Chelex DNA Extraction Combined with Loop-Mediated Indirect PCR

ZHENG Ming1，BIAN Chuan-zhou1，LIU Zhong-min2
(1. Zhengzhou College of Animal Husbandry Engineering, Zhengzhou 450011, China；
2. Biology Institute Co. Ltd., Henan Academy of Sciences, Zhengzhou 450008, China)

Objective∶ To develop a loop-mediated indirect PCR method for rapid detection ofL.monocytogenein meat products.Methods∶ Chelex-100 resin was used to directly extract template DNAs from meat products. Two probes targeted the conserved region ofhly Agene ofL.monocytogenewere designed according to the published sequences and used to label the Lectin gene fragment of soybean (reporter gene). After hybridization with target genes, gap filling and cyclization, the reporter gene was amplified by PCR for detecting the target genes. Results∶ The developed detection system showed a detection limit of lower than 100 CFU/g (mL) and had no obvious cross-reactivity with other foodborne pathogenic bacteria. The positive rate of 200 meat product samples was detected to be 2.5%, which was consistent with the result obtained by traditional bacterial separation. Conclusion∶The loop-mediated indirect PCR method allows the rapid, sensitive and specific detection of L.monocytogene contamination in meat products.

loop-mediated indirect PCR；meat products；L. monocytogene

TS201.3

A

1002-6630(2012)10-0190-05

2011-05-11

河南省重點科技攻關項目(092102110073)

鄭鳴(1975—)，男，講師，碩士，研究方向為微生物遺傳學。E-mail：floatingzm@163.com