高效液相色譜串聯質譜法測定蔬果中啶酰菌胺和環酰菌胺殘留

郭慶龍，崔淑華*，段 浩，林黎明，錢家亮，許美玲，吳淑秀

(1.黃島出入境檢驗檢疫局，山東 青島 266555；2.臨沂出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，山東 臨沂 276034；3.山東省檢驗檢疫科學技術研究院，山東 青島 266002)

高效液相色譜串聯質譜法測定蔬果中啶酰菌胺和環酰菌胺殘留

郭慶龍1，崔淑華2,*，段 浩2，林黎明3，錢家亮2，許美玲2，吳淑秀2

(1.黃島出入境檢驗檢疫局，山東 青島 266555；2.臨沂出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，山東 臨沂 276034；3.山東省檢驗檢疫科學技術研究院，山東 青島 266002)

建立蔬菜和水果中啶酰菌胺和環酰菌胺的高效液相色譜串聯質譜檢測方法。將試樣中殘留的啶酰菌胺和環酰菌胺用含1%乙酸的乙腈溶液均質提取，提取液混合使用乙二胺-N-丙基硅烷和十八烷基硅烷鍵合相基質分散凈化，用高效液相色譜串聯質譜檢測和確證，外標法定量；方法通過空白基質溶液稀釋標準建立校正的標準曲線，以消除基質效應。結果表明：啶酰菌胺和環酰菌胺在1～100μg/L范圍內具有良好的線性關系，相關系數分別為0.9996和0.9997；在5～50μg/kg范圍內，平均添加回收率在77.7%～93.8%之間，相對標準偏差在2.1%～6.3%之間。啶酰菌胺和環酰菌胺方法定量限分別為1.32μg/kg和1.20μg/kg，檢出限分別為0.395μg/kg和0.361μg/kg。

液相色譜串聯質譜；啶酰菌胺；環酰菌胺；蔬菜；水果

啶酰菌胺(boscalid)和環酰菌胺(fenhexamid)是新型酰胺類內吸性殺菌劑，這兩種殺菌劑對防治灰霉病、菌核病和各種腐爛病等病害非常有效，并且對其他藥劑的抗性菌亦有效，主要用于包括蔬菜、果樹和大田作物等病害的防治。由于其特有的作用機理不易產生交互抗性，加之對作物安全、與環境相容性良好，是應用前景很好的兩種新型酰胺類殺菌劑[1-6]。基于安全考慮，CAC、歐盟和日本等國家規定規定啶酰菌胺和環酰菌胺在各類食品中最高殘留限量在ND～40mg/kg和0.02～30mg/kg之間[7-9]。國內外對該化合物殘留檢測方法的報道較少[10-18]，而且國內殘留分析前處理方法較繁瑣。因此，研究食品中啶酰菌胺和環酰菌胺快速準確的分析方法極為迫切和必要。本研究參照QuEChERS前處理技術的分散固相萃取技術[19-20]，采用混合吸附劑凈化，擬建立高效液相色譜串聯質譜(high-performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，HPLC-MS/MS)測定蔬菜和水果中啶酰菌胺和環酰菌胺的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4種基質(草莓、葡萄、黃瓜、大蔥) 市售。

乙腈、甲醇、乙酸(均為色譜純) 德國Merke公司；氯化鈉、無水硫酸鎂(分析純，用前在450℃烘5h，200℃時取出至于干燥器內備用) 國藥集團化學試劑有限公司；Cleanert PSA凈化劑(40～60μm)、Cleanert ODS C18-N(未封端)凈化劑(40～60μm)、Cleanert Pesti Carb 凈化劑(120～400μm) 天津博納艾杰爾科技有限公司；啶酰菌胺(純度≥99.5%)、環酰菌胺標準品(純度≥99.5%)德國Dr Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 儀器與設備

1200快速液相色譜儀-6410Triple Quad質譜/質譜聯用儀 美國Agilent公司；5810R型離心機德國Eppendorf公司；ULTRA-TURRAX T-18 basic型均質器、MS3基本型旋渦混合器 德國IKA公司；MilliQ超純水器 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

標準儲備溶液：分別準確稱取啶酰菌胺和環酰菌胺標準品12.56mg置于50mL小燒杯中，用乙腈溶解后轉移至25mL容量瓶中，然后多次洗滌小燒杯并將其轉移至容量瓶中，最后用乙腈定容至刻度，分別配成500μg/mL標準儲備溶液。

標準中間溶液：準確吸取啶酰菌胺和環酰菌胺標準儲備溶液1mL于50mL棕色容量瓶中，用含1%乙酸的乙腈溶液定容至刻度，配成10μg/mL啶酰菌胺和環酰菌胺混合標準中間液。然后準確吸取1mL 10μg/mL標準中間溶液于10mL容量瓶中，用含1%乙酸的乙腈溶液定容，配成1.0μg/mL標準中間溶液。

標準工作溶液：根據需要使用前用空白樣品基質溶液稀釋標準中間溶液，配制成適當質量濃度的標準工作溶液。

1.3.2 測定條件

1.3.2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18(2.1mm×100mm，1.8μm)；流動相：甲醇-5mmol乙酸銨溶液(pH3.5)(75:25，V/V)；流速：0.2mL/min；進樣體積：5μL；柱溫：30℃。

1.3.2.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監測(multi-reaction monitoring，MRM)；霧化器壓力：40psi；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：9.0mL/min；毛細管電壓：3500V；監測離子對、毛細管出口電壓/碎裂電壓和碰撞能量等質譜采集參數見表1。

表1 啶酰菌胺和環酰菌胺質譜采集參數Table 1 Instrumental parameter setting for MS-MS detection of boscalid and fenhexamid

1.3.3 樣品前處理

稱取5g(精確至0.01g)均勻樣品置于50mL離心管中，準確加入10mL含1%乙酸的乙腈溶液，2.0g無水硫酸鎂，1.0g氯化鈉，均質提取。以5000r/min離心5min。吸取2.0mL上層有機相轉移至裝有100mg Cleanert ODS C18-N、50mg Cleanert PSA粉末的離心管中，渦旋2min，5000r/min離心5min。取上清液過0.22μm濾膜后，供液相色譜-質譜/質譜儀測定。

2 結果與分析

2.1 流動相的選擇

以乙腈-0.1%甲酸溶液和乙腈-5mmol乙酸銨溶液作為流動相時，調整流動相比例均不能將啶酰菌胺和環酰菌胺進行分離。以甲醇-5mmol乙酸銨(75:25，V/V)做流動相等度洗脫即可實現這兩種化合物的有效分離，色譜峰對稱尖銳，峰形良好。

2.2 質譜條件優化

采用1mg/L的待測化合物的標準溶液以流動注射的方式分別用ESI正離子和負離子模式進行全掃描，發現這兩種農藥在ESI+模式下的響應值均大大高于在ESI-模式下的響應值，因此選擇采用ESI+電離模式。本研究正離子模式全掃描發現啶酰菌胺(分子式為C18H12Cl2N2O)和環酰菌胺(分子式為C14H17Cl2NO2)存在很明顯的同位素分子離子峰，分別為343.1、345.1和302.1和304.1。采用0.1mg/L啶酰菌胺和環酰菌胺的標準溶液分別對毛細管出口電壓進行優化，從中選出豐度最高的毛細管出口電壓作為最佳毛細管出口電壓。然后分別對不同母離子產生的子離子及碰撞能力進行優化，從中選出豐度最高的碰撞能量作為最佳碰撞能力，選擇兩個豐度比較高的子離子作為定性和定量離子，建立多離子反應監測模式，啶酰菌胺和環酰菌胺的質譜采集參數見表1，啶酰菌胺和環酰菌胺標準品多反應監測色譜圖見圖1。

圖1 0.01μg/mL標準溶液M R M色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of 0.01μg/mL boscalid and fenhexamid standard

2.3 樣品基質效應的消除

電噴霧離子源容易受樣品基質的影響。樣品基質對離子化有抑制作用，草莓、葡萄對農藥離子化影響較弱，黃瓜、大蔥對農藥離子化影響較強。為消除樣品基質效應，應以空白樣品提取液作為標準溶液的稀釋溶液，這樣可使標樣和樣品溶液具有同樣的離子化條件，從而消除樣品基質效應。

2.4 提取條件的選擇

比較乙腈和乙酸乙酯的提取效果，發現采用乙酸乙酯作為提取液時，會提取出更多的色素，對化合物離子化抑制更強。同時，采用乙腈提取時，具有可利用鹽析效應去除水分，提取樣品時不需加入大量無水硫酸鈉或無水硫酸鎂等優勢。另外發現，對乙腈提取液使用Cleanert PSA凈化劑基質固相分散凈化時，其對環酰菌胺產生強吸附作用，將含1%乙酸的乙腈溶液作為提取液則吸附作用消失，因此，選擇使用含1%乙酸的乙腈溶液作為提取溶劑。

2.5 凈化條件的選擇

基質分散凈化常用的凈化劑有乙二胺-N-丙基硅烷(primary secondary amine，PSA)、十八烷基硅烷鍵合相(C18)、石墨化炭(Pesti Carb)和氨基(NH2)。PSA去除脂肪酸效果較好，在去除色素、甾醇和維生素方面效果一般，而C18和Pesti Carb去除維生素、色素、甾醇的能力較好，NH2與PSA凈化范圍一致，但離子交換能力較PSA弱。凈化劑在去除雜質的同時也可能對目標化合物產生吸附，將2mL 0.01μg/mL啶酰菌胺和環酰菌胺混合標液分別經不同質量的Cleanert ODS C18-N(未封端)、Cleanert PSA和Cleanert Pesti Carb渦旋凈化，處理后的回收率數據見表2。

表2 啶酰菌胺和環酰菌胺混合標準溶液經吸附劑處理后的回收率Table 2 Recoveries of boscalid and fenhexamid residues after adsorbed by C18, PSA, Pesti Carb respectively

從表2可看出，Cleanert ODS C18-N對啶酰菌胺和環酰菌胺吸附很小，但當Cleanert ODS C18-N用量增加至200mg時，其對兩種農藥都產生一定程度的吸附。25mg和50mg Cleanert PSA對這兩種農藥吸附較弱，但隨其用量的增加，Cleanert PSA對啶酰菌胺和環酰菌胺吸附作用增強，尤其對環酰菌胺吸附更強，10 0 mg Cleanert PSA凈化處理環酰菌胺后的回收率為79.3%。Cleanert Pesti Carb對2種農藥均有一定程度的吸附作用，10mg Cleanert Pesti Carb對啶酰菌胺和環酰菌胺吸附回收率分別為40.8%和78.4%，并且隨Cleanert Pesti Carb用量增加吸附更強。本研究結合凈化劑去雜特性和對目標化合物的吸附情況，選擇100mg Cleanert ODS C18-N和50mg Cleanert PSA對蔬菜和水果中基質干擾物進行凈化。實際試驗發現，由于1mL提取液中僅含有0.5g樣品基質，采用100mg Cleanert ODS C18-N和50mg Cleanert PSA對色素等雜質去除效果良好。采用上述方法凈化處理后，對比圖2、3可看出凈化后目標物周圍無雜質峰干擾，滿足檢測要求。

圖2 大蔥空白樣品中啶酰菌胺和環酰菌胺的MRM色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of boscalid and fenhexamid in a blank welsh onion sample

圖3 大蔥加標樣品中啶酰菌胺和環酰菌胺的MRM色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of a welsh onion sample spiked with boscalid and fenhexamid

2.6 方法的線性范圍

將空白樣品按上述提取和凈化過程進行處理，得到空白基質提取凈化液。用該基質溶液將標準液稀釋成濃度為1、2、5、10、20、50、100μg/L標準工作液，HPLC-MS/MS進樣分析后，以峰面積(Y)對化合物質量濃度(X)作線性回歸，繪制的啶酰菌胺和環酰菌胺標準曲線和線性相關系數分別為Y＝814.87X－398.77，r＝0.9996和Y＝854.82X－277.97，r＝0.9997，表明在1～100μg/L范圍內線性良好。

2.7 方法的檢出限和定量限

方法檢出限以空白樣品基質稀釋標準曲線上的最低濃度出峰時，取信噪比RSN＝3和樣品處理過程的稀釋倍數(本方法稀釋倍數為0.5倍)計算得出。定量限是以空白樣品基質稀釋標準曲線上的最低濃度出峰時，取信噪比RSN為10和樣品處理過程的稀釋倍數(本方法稀釋倍數為0.5倍)計算得出。啶酰菌胺在黃瓜基質中的方法檢出限和定量限分別為0.395μg/kg和1.32μg/kg。環酰菌胺在黃瓜基質中的方法檢出限和定量限分別為0.361μg/kg和1.20μg/kg。

2.8 方法的回收率和精密度

表3 樣品中啶酰菌胺和環酰菌胺的回收率和精密度(n=6)Table 3 Mean recoveries and precisions of boscalid and fenhexamid in sample (n=6)

在陰性草莓、黃瓜、大蔥和葡萄樣品中添加3個濃度水平的混合標準液，按上述前處理方法進行處理，做回收率實驗，每個水平重復6次，測精密度，結果見表3。由表3可見，不同添加濃度的平均回收率測定范圍在77.7%～93.8%之間，相對標準偏差在2.1%～6.3%之間，其結果表明方法的準確度及精密度均可達到定量分析的要求。

3 結 論

本實驗參照QuEChERS前處理技術的分散固相萃取技術，建立蔬菜和水果中啶酰菌胺和環酰菌胺殘留的液相色譜串聯質譜檢測方法。該方法用含1%乙酸的乙腈溶液提取樣品中的啶酰菌胺和環酰菌胺殘留，同時采用乙二胺-N-丙基硅烷和十八烷基硅烷鍵合相混合吸附劑對樣品提取液進行凈化，十八烷基硅烷鍵合相彌補了乙二胺-N-丙基硅烷不吸附油脂、色素等弱極性雜質的缺點，使凈化更為充分。將此前處理方法結合HPLC-MS/MS應用于蔬菜和水果中啶酰菌胺和環酰菌胺的同時定性確證和定量檢測，取得了滿意的結果。該方法具有簡單快速、靈敏、準確等特點，能滿足國外最高殘留限量要求。

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Determination of Boscalid and Fenhexamid Residues in Fruits and Vegetables by HPLC-MS/MS

GUO Qing-long1，CUI Shu-hua2,*，DUAN Hao2，LIN Li-ming3，QIAN Jia-liang2，XU Mei-ling2，WU Shu-xiu2
(1. Huangdao Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qingdao 266555, China；2. Inspection and Quarantine Technology Center, Linyi Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Linyi 276034, China；3. Shandong Inspection & Quarantine and Science &Technology Academy, Qingdao 266002, China)

A liquid chromatography-tandem mass spectrometry method was established to determine boscalid and fenhexamid residues in fruits and vegetables. Analytes were extracted from samples using 1% acetic acid acetonitrile, and then purified by solid phase extraction cartridge packaged with sorbent primary secondary amine (PSA) and C18. The residues were determined by high-performance liquid chromatography coupled with tandem MS (HPLC-MS/MS) using external standard method, and the interference of matrix was deducted by the matrix-matched calibration standards curve. A good linearity of calibration curve was exhibited over a concentration range of 1μ g/L to 100μ g/L for boscalid and fenhexamid with a correlation coefficient of 0.9996 and 0.9997, respectively. Average recoveries for boscalid and fenhexamid in 4 samples at spiked levels of 5 － 50 μg/kg were between 77.7% and 93.8%, with a relative standard deviations between 2.1% and 6.3%. For boscalid and fenhexamid, the limit of quantification were 1.32, 1.20 μg/kg and the limit of detection were 0.395, 0.361 μg/kg, respectively.

HPLC-MS/MS；boscalid；fenhexamid；fruits；vegetables

TS207.5

A

1002-6630(2012)10-0255-05

2011-05-06

國家質檢公益性行業科研專項(200910145-2)

郭慶龍(1981—)，男，農藝師，碩士，研究方向為植物檢疫與農產品安全。E-mail：long_xian1@163.com

*通信作者：崔淑華(1980—)，女，工程師，碩士，研究方向為農獸藥殘留分析。E-mail：cuishuh@163.com