槲皮素對小鼠1-細胞胚胎體外發育能力的影響

賈秀芬

（聊城職業技術學院醫學院，山東 聊城 252000）

槲皮素對小鼠1-細胞胚胎體外發育能力的影響

賈秀芬

（聊城職業技術學院醫學院，山東 聊城 252000）

目的 為完善小鼠早期胚胎體外培養體系，了解槲皮素對小鼠1-細胞胚胎體外發育的影響。方法 以CZB為基礎培養液，添加不同濃度（500、50、5、1、0.5、0.2、0.1 μm）的槲皮素作為試驗組，添加等量二甲基亞砜（DMSO）作為對照組，觀察不同濃度槲皮素對胚胎發育到囊胚各階段的影響。結果 當槲皮素濃度超過50 μm時，對胚胎發育有毒性效應；0.1～1 μm濃度槲皮素對胚胎發育有促進作用，特別是0.5 μm槲皮素能明顯提高胚胎的囊胚形成率。結論 0.5 μm槲皮素能促進小鼠早期胚胎的體外發育。

槲皮素；細胞胚胎；體外發育

在體內，胚胎發育過程中會通過各種酶促反應和代謝途徑產生內源性的活性氧簇（ROS），即在有氧代謝過程中會產生ROS。不同階段產生不同量的ROS，而且胚胎發育的各階段對ROS的敏感性也不同，如果不能迅速、有效地去除，ROS能破壞一系列的大分子物質，甚至導致胚胎的死亡。但體內存在著有效去除ROS的酶促機制和非酶促機制。包括ROS清除酶像超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶，以及一些小分子量物質如谷胱甘肽、維生素E、維生素C、尿酸等。而在體外不存在這樣的保護機制，因此，筆者在體外胚胎培養液中加入抗氧化劑——槲皮素，觀察它對胚胎發育的影響。

槲皮素（quercetin）屬類黃酮物質中的黃酮醇，它是人類膳食中常見的類黃酮物質，也是一些中草藥的有效成分。據文獻報道，槲皮素在體外可通過直接清除活性氧自由基、螯合金屬離子、抑制LDL及DNA氧化損傷，發揮其抗氧化作用[1]。在體內，槲皮素、維生素C灌胃后大鼠外周血總抗氧化能力明顯上升且程度相近，而維生素E灌胃前后外周血總抗氧化能力無明顯變化。在體外，槲皮素被細胞胚胎吸收后抗氧化能力強于傳統的抗氧化劑維生素C、維生素E[2]。同樣是抗氧化劑，考慮到維生素E和維生素C對胚胎發育的影響不大，故尋找槲皮素促進胚胎發育的最佳濃度，以提高胚胎體外發育能力。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

為昆明系性成熟小鼠，購自哈爾濱醫科大學第三臨床醫學院實驗動物中心（動物質量合格證號：醫動字第09-2-1號）。小鼠飼養采用自由取食和飲水方式，人工控溫22～24℃，光照周期為12 h光照、12 h黑暗。

1.2 主要試劑

所用試劑除孕馬血清促性腺激素（PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（HCG）購自寧波第二激素廠外，其余均購自Sigma公司，CZB培養液本實驗室自配。

1.3 實驗方法

1.3.1 超排和胚胎的收集 雌性小鼠腹腔注射PMSG7.5 IU/只，48 h后腹腔注射HCG7.5 IU/只，進行超數排卵[3]，并與雄鼠1∶1合籠，注射HCG 21～24 h后將見栓鼠采用脫頸法處死，體視顯微鏡在Hepes-CZB操作液中劃開輸卵管壺腹部，收集受精卵。被顆粒細胞包圍的受精卵，用0.1%的透明質酸酶處理，再用Hepes-CZB洗3次后進行培養。

1.3.2 實驗分組 因槲皮素為不溶于水的抗氧化劑，故將其溶于二甲基亞砜中，使二甲基亞砜濃度保持在1/1 000，再加入CZB 培養液中，使槲皮素濃度分別達到 500、50、5、1、0.5、0.2、0.1 μm作為試驗組，對照組則以加入等量二甲基亞砜作對照，基礎培養液CZB則為空白組。

1.3.3 胚胎培養 將20 μl微滴覆以石蠟油，在5%CO2、95%空氣、37℃飽和濕度的CO2培養箱中平衡4～5 h，每滴最多培養10枚胚胎。每隔24 h觀察一次，記錄胚胎發育情況，直至144 h結束。

1.3.4 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件對實驗數據進行χ2檢驗，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結果與分析（見表1）

表1 不同濃度槲皮素對1-細胞胚胎體外發育的影響[n（%）]

由表1可知，在發育到二細胞時，除槲皮素濃度為50 μm的發育率低于空白組外，其余試驗組各濃度胚胎發育率均高于空白組，以槲皮素濃度為1 μm發育率最高，然而無顯著性差異。四細胞發育率以1 μm和0.5 μm濃度發良率較高，然而無顯著性差異。50 μm和0.5μm濃度的四細胞發育率比較有顯著性差異。八細胞-桑椹胚發育率以0.5 μm濃度最高，但無顯著性差異。囊胚發育率除50 μm濃度低于空白組外，其余各濃度胚胎發育率均高于空白組，以0.5 μm濃度最高，同空白組和試驗組50 μm濃度比較有顯著性差異。500 μm濃度的槲皮素處理的受精卵，停止在1-細胞不發育，而且細胞膜出現許多小泡（見圖1），顯示了該藥的毒性效應。空白組包括正常受精卵，二細胞胚胎，四細胞胚胎（×100），八細胞胚胎-桑葚胚及囊胚（正在孵出的及已經孵出的，×400）胚胎發育的各個時期見圖2。

圖1 500 μm濃度的槲皮素處理的受精卵細胞膜（×300）

圖2 空白組胚胎發育的不同階段

3 討論

通過研究體內發育的小鼠卵母細胞及早期胚胎中H2O2含量發現：未受精的卵母細胞中H2O2水平較低，胚胎發育各階段的早期胚胎細胞中H2O2水平高于以后發育的任何時期的水平，離體培養的二細胞中期小鼠胚胎H2O2水平上升，以后高居不下[4]。本實驗在CZB培養液中添加不同濃度的槲皮素觀察對受精卵體外發育的影響。濃度選擇在50 μm以下，是因為有研究[5]表明，該濃度以上對細胞有毒性效應。通過本試驗結果發現槲皮素在0.1～1 μm濃度段對胚胎發育有明顯促進作用，特別是0.5 μm濃度，囊胚發育率較高，表明抗氧化能力最佳。這一實驗結果與許多實驗結果一致。同時試驗組四細胞發育率同空白組相比有顯著性差異，說明槲皮素的抗氧化作用主要在早期胚胎發育中起作用，特別是對二細胞、四細胞發育的影響，這可能與二細胞的發育阻滯相關聯。在八細胞-桑椹胚發育率上，僅0.5 μm濃度表現為促進作用，其余試驗組濃度均低于空白組，到囊胚發育率上試驗組各濃度（50 μm濃度除外）卻又高于空白組，這一現象有待進一步研究。盡管高濃度槲皮素不利于胚胎發育，本實驗還是選擇了500 μm濃度觀察對胚胎的毒性效應。在500 μm時，發現受精卵停止在1-細胞期，且細胞膜起泡。如Yuling[6]等報道，以2，4-D作為活性氧的來源，精子細胞數目及其活力明顯降低，精子細胞的形態也發生改變。當同時加入槲皮素時，結果發生明顯改變：精子細胞數目明顯增加，較多細胞保持了質膜的完整。說明槲皮素通過減少細胞內活性氧水平及質膜過氧化作用發揮其抗氧化能力。據報道[7]，槲皮素能抑制H2O2誘導胰島細胞凋亡，保持細胞形態正常，其原理是槲皮素主要清除胞內異常增多的自由基。周蕾等[8]報道，槲皮素對柔紅霉素致大鼠心肌細胞損傷的保護作用其機理可能與抗氧化作用有關。陳中華等[9]報道，槲皮素對紫外線損傷NIH3T3細胞的保護作用是通過清除細胞內的活性氧自由基，維持細胞的線粒體膜電位，抑制細胞凋亡。曹文軍等[10]證實，槲皮素可顯著提高體內一種重要的清除自由基的酶GSH-Px活性，從而保護缺血再灌注對心肌損傷。所有這些文獻，都充分證明了槲皮素對細胞的保護作用與其抗氧化特性相關，與本實驗結果一致，從而為槲皮素應用于胚胎體外培養提供了依據。目前，胚胎體外培養體系雖有所改善，但至今仍不是最好的培養條件，不能代替生殖管道內的有利條件。盡管哺乳動物的胚胎有明顯的可塑性，能在很大范圍的培養條件下形成囊胚，然而亞培養條件可能不僅會破壞植入前胚胎的基因表達模式，而且會影響出生后的發育，甚至后代的生長和生理。自然界中天然的槲皮素為胚胎培養體系的完善提供了廣闊前景，故需將槲皮素對胚胎發育的促進機制進行詳盡的探討。

[1]蘇俊鋒，郭長江.食物黃酮槲皮素的抗氧化作用[J].解放軍預防醫學雜志，2001，19（3）：229～231.

[2]蘇俊鋒，郭長江，李云峰，等.槲皮素體內外抗氧化作用的比較研究[J].Chin J Appl Physiol，2002，18（4）：382～386.

[3]A納吉，M格斯膝斯坦，K文特斯騰，等.小鼠胚胎操作實驗手冊[M].北京：科學出版社，2004.

[4]Nasr-Esfahani M H，Johnson M H，Aitken J R，et al.Hydrogen peroxide levels in mouse oocytes and early cleavage stage embryos developed in vitro or in vivo[J].Development，2000，109（2）：501～507.

[5]單智焱，劉慧雯.Quercetin對HepG2細胞的抑制作用及PDGFR-β的表達[J].哈爾濱醫科大學學報，2005，39（1）：38～40.

[6]Yuling M I，Caiqiao ，Kazuyoshi.Quercetin protects spermatogonial cells from 2，4-D-Induced oxidative damage in embryonic chickens[J].Journal of Reproduction and Development，2007，53（4）：749～754.

[7]金永亮，葉春玲，任省華，等.槲皮素對 H2O2誘導的胰島RIN-mβ細胞凋亡的影響[J].中成藥，2008，30（5）：767～769.

[8]周蕾，賴永洪.槲皮素對柔紅霉素致大鼠心肌細胞損傷的保護作用[J].實用兒科臨床雜志，2006，21（13）：855～871.

[9]陳中華，張秀珍.槲皮素對紫外線損傷NIH3T3細胞的保護作用研究[J].生命科學儀器，2008，6（5）：27～29.

[10]曹文軍，陳瑞芬，劉國貞.槲皮素對缺血再灌注大鼠心肌損傷的保護作用[J].首都醫科大學學報，2004，25（3）：311～313.

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1671-1246（2012）07-0114-02