市售仔蝦中副溶血性弧菌的檢測

顧冬花

（青海大通縣樺林鄉(xiāng)獸醫(yī)站 810100）

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，簡稱Vp）是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌（Halophilic bacteria），最早是由Fujino等于1953年從日本一個食物中毒患者初次分離得到。該菌為海洋性生物寄生菌，主要分布于近海岸的海水、海底沉積物及魚、貝類、海帶及蝦等海洋生物中。Vp是食用海產(chǎn)品引起腹瀉、嘔吐和發(fā)燒等腸胃炎的主要致病菌之一，也是近年來世界范圍內(nèi)由Vp感染引發(fā)食物中毒趨于嚴(yán)重的食源性公共衛(wèi)生問題之一。由Vp引起的食物中毒占日本食物中毒病例數(shù)的20%～30%[1]。在歐洲和北美地區(qū)也曾多次暴發(fā)過Vp食物中毒事件[2]。根據(jù)我國的食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，Vp中毒的發(fā)生規(guī)模及人群暴露規(guī)模呈明顯上升趨勢，均超過沙門氏菌食物中毒而躍居于微生物食源性疾病爆發(fā)的首位[3，4]，特別是在一些沿海城市，由該菌引起的食物中毒占細(xì)菌性食物中毒總數(shù)的比例高達(dá)60%以上[5-7]。由于本地銷售的仔蝦等海產(chǎn)品均為外省調(diào)入，在包裝或運(yùn)輸過程中污染Vp的機(jī)率可能增加，為了初步摸清Vp在本地市售仔蝦中的帶菌率，提高相關(guān)檢疫機(jī)構(gòu)對Vp的重視程度，降低食源性疾病的風(fēng)險，2009年3～7月筆者對隨機(jī)采集于西寧市某幾個農(nóng)貿(mào)市場的70份仔蝦樣品進(jìn)行了常規(guī)病原分離。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 隨機(jī)采取西寧市幾個農(nóng)貿(mào)市場市售仔蝦70份，（10只/份），置4℃冰箱備用。

1.1.2 氧化酶試劑 1%鹽酸二甲基對苯二胺溶液（用前配制）、1%α萘酚-乙醇溶液。

1.1.3 培養(yǎng)基 3%氯化鈉堿性蛋白胨水、硫代硫酸鈉、檸檬酸鈉、膽鹽、蔗糖瓊脂（TCBS）平板，嗜鹽菌選擇性平板，氯化鈉蔗糖瓊脂平板，SS平板，3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板，3%氯化鈉三糖鐵（TSI）瓊脂斜面，0%、3%、6%、8%、11%NaCl胰胨水及各種生化培養(yǎng)基均由青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系傳染病實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.4 試驗(yàn)動物 健康昆明系小白鼠5只（14～16g）均購于青海地方病研究所。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備 無菌剝?nèi)ノr殼后稱取25g（含內(nèi)臟和肉）置于滅菌研缽中，用滅菌剪刀充分剪碎后研磨，分裝于500ml滅菌三角瓶中，再加入225ml 3%氯化鈉堿性蛋白胨水充分振蕩10min，使其成為1∶10稀釋液，再用1ml滅菌吸管吸取1∶10稀釋液1ml作10倍遞增稀釋，制成1∶100和1∶1000稀釋液。

1.2.2 增菌 分別用1ml滅菌吸管吸取上述3個稀釋液（1∶10、1∶100、1∶1000）各1ml，接種于裝有9ml 3%氯化鈉堿性蛋白胨水的滅菌試管中，每一稀釋度接種3管，37℃增菌振蕩培養(yǎng)8～16h。

1.2.3 分離培養(yǎng) 分別勾取上述變混濁的增菌液1～2環(huán)，劃線接種于氯化鈉蔗糖瓊脂平板、嗜鹽菌選擇性平板和SS平板，于37℃培養(yǎng)18～36h。觀察菌落形態(tài)并分別勾取1/3疑似菌落涂片進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。

1.2.4 細(xì)菌純化培養(yǎng) 分別挑取TCBS平板上的3個疑似菌落于3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)，置4℃冰箱備用。

1.2.5 初篩試驗(yàn) （1）細(xì)胞色素氧化酶試驗(yàn)。分別挑取純培養(yǎng)的單個菌落涂布于潔凈的濾紙條上，然后滴加1%鹽酸二甲基對苯二胺溶液一滴，陽性者再滴加1%α萘酚-乙醇溶液一滴，判定結(jié)果。（2）3%氯化鈉三糖鐵試驗(yàn)。分別挑取純培養(yǎng)的單個菌落接種于3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面并穿刺底層，37℃培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果。（3）嗜鹽性試驗(yàn)。分別挑取純培養(yǎng)的單個菌落依次接種于0%NaCl胰胨水、3%NaCl胰胨水、6%NaCl胰胨水、8%NaCl胰胨水和11%NaCl胰胨水中，37℃恒溫培養(yǎng)24～48h后，觀察結(jié)果。

1.2.6 生化試驗(yàn) 分別勾取初篩試驗(yàn)陽性的疑似Vp接種于葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、蕈糖、靛基質(zhì)、甲基紅、硝酸鹽、乳糖、蔗糖、肌醇、水楊苷、V-P、硫化氫、尿素酶、鼠李糖和棉子糖培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24～48h，觀察結(jié)果。

1.2.7 致病性試驗(yàn) 將符合Vp生化結(jié)果的菌株分別接種于3%氯化鈉三糖鐵斜面上，37℃培養(yǎng)18～24h后用滅菌生理鹽水無菌洗下并與麥?zhǔn)媳葷峁苓M(jìn)行比濁，均選取3×108濃度的菌懸液分別腹腔注射小白鼠各1只，0.5ml/只，同時用生理鹽水腹腔注射小白鼠1只作對照。

2 結(jié)果

2.1 菌落形態(tài)及培養(yǎng)特性

在嗜鹽菌選擇性平板上為小圓形、邊緣整齊的淺黃色菌落，經(jīng)過2～3次傳代純培養(yǎng)后均變成均勻的小菌落，呈黃色，菌落光滑濕潤、隆起， 直徑為0.2～1mm，中心稍混濁；在氯化鈉蔗糖瓊脂平板上為圓形菌落，直徑2～3mm，半透明或不透明，沒有粘性；在SS瓊脂平板上出現(xiàn)了圓形、扁平、邊緣整齊、光滑濕潤、蠟滴狀的粘韌性菌落1～2mm；在TCBS平板上有4個副溶血性弧菌可疑藍(lán)綠色菌落生長，菌落形態(tài)均為圓形、邊緣整齊、濕潤、稍混濁、半透明，直徑2～4mm。

2.2 涂片、染色及鏡檢

挑取可疑菌落涂片、革蘭氏染色鏡檢可見到兩端濃染，呈棒狀、弧狀或卵圓狀多形態(tài)的革蘭氏陰性菌。

2.3 初篩試驗(yàn)

2.3.1 細(xì)胞色素氧化酶 滴加1%鹽酸二甲基對苯二胺溶液變成粉紅色，再滴加1%α萘酚-乙醇溶液變成藍(lán)色，細(xì)胞色素氧化酶試驗(yàn)陽性。

2.3.2 3%氯化鈉三糖鐵 底層變黃、斜面變紅、不產(chǎn)氣、不產(chǎn)硫化氫。

2.3.3 嗜鹽性 在3%、6%和8%氯化鈉胰胨水中生長良好，0%和11%氯化鈉胰胨水中不生長。

2.4 生化鑒定

結(jié)果詳見附表。

附表 副溶血性弧菌生化反應(yīng)結(jié)果表

2.5 致病性試驗(yàn)

4只小白鼠36～72h內(nèi)死亡，對照組小白鼠飼喂1周仍健活。采取臟器進(jìn)行細(xì)菌分離，獲得與原分離菌株一致的小桿菌，試驗(yàn)結(jié)果表明分離菌具有較強(qiáng)的致病性。

3 討論

（1）在70份仔蝦中共分離出4株疑似Vp菌株，經(jīng)細(xì)菌菌落形態(tài)及培養(yǎng)特性觀察、細(xì)胞色素氧化酶試驗(yàn)、嗜鹽性試驗(yàn)和生化試驗(yàn)等證實(shí)分離出的4株細(xì)菌均為Vp。增菌培養(yǎng)陽性管數(shù)為（1，0，0），應(yīng)用3管法查SN 0173-92出口食品副溶血性弧菌檢驗(yàn)方法的MPN表，結(jié)果每100g仔蝦中Vp 的MPN值為360。（2）此次檢測結(jié)果顯示，西寧市市售仔蝦中存在Vp污染，致病性試驗(yàn)也表明分離菌對小白鼠有致死效應(yīng)，食用該產(chǎn)品存在安全隱患。由于本市市場銷售的海產(chǎn)品種類比較單一，且大多為冷凍包裝或活體長途運(yùn)輸過來的海產(chǎn)品，新鮮度與其產(chǎn)區(qū)相比有所降低，而長途運(yùn)輸和調(diào)運(yùn)海產(chǎn)品的中間環(huán)節(jié)也可能增加污染Vp的風(fēng)險，應(yīng)該引起相關(guān)檢疫部門和廣大消費(fèi)者的注意。（3）Vp是近幾年來越來越受到重視的一種海產(chǎn)品食物中毒菌，在很多國家都有Vp食物中毒發(fā)生，以日本及我國沿海地區(qū)發(fā)病率最高。Vp引起中毒的主要癥狀是嘔吐、水樣腹瀉或血便，甚至敗血癥、皮膚大皰性損害、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[8]；典型癥狀是腹部或臍周呈現(xiàn)陣發(fā)性腹絞痛，水樣腹瀉后出現(xiàn)膿血便，同時伴有惡心、嘔吐，體溫在38～39℃，個別患者可達(dá)40℃以上，甚至發(fā)生休克、昏迷，若搶救不及時可造成死亡[9]。因其致病性強(qiáng)，其發(fā)病急，傳播快，感染源多，在人群中流行的持續(xù)時間長，屬國際上檢疫傳染病之一。因此在食用各類海產(chǎn)品時一定要注意對該菌的衛(wèi)生防范，嚴(yán)把海產(chǎn)品生產(chǎn)、加工、包裝和運(yùn)輸?shù)馁|(zhì)量關(guān)，避免交叉污染，避免Vp引起食物中毒的發(fā)生。在食用海產(chǎn)品時要做到低溫貯藏，加工過程中要煮熟、煮透，切生、熟食物的廚具要分開，用完后進(jìn)行嚴(yán)格的消毒處理。同時生、熟食物應(yīng)分開放置，避免造成交叉污染。