軟棗獼猴桃多糖的分離與純化及其分子質量的測定

潘 松，劉長江*，梁 爽

(沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866)

軟棗獼猴桃多糖的分離與純化及其分子質量的測定

潘 松，劉長江*，梁 爽

(沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110866)

對通過水提醇沉法提取、Sevag法脫蛋白得到的軟棗獼猴桃多糖進行分離純化，利用DEAE-纖維素 52離子交換層析對軟棗獼猴桃多糖進行初步分離，得到4種軟棗獼猴桃多糖組分；利用葡聚糖凝膠對軟棗獼猴桃多糖組分進一步分離的最佳條件為葡聚糖凝膠型號為Sephadex G-200、層析柱規(guī)格為D1.1cm×100cm、多糖質量濃度為10g/L。以此條件分離，得到含量較高的軟棗獼猴桃多糖-Ⅱ純品。通過Sephadex G-200凝膠柱層析鑒定軟棗獼猴桃多糖-Ⅱ是均一的純多糖，通過紫外光譜鑒定軟棗獼猴桃多糖-Ⅱ不含核酸及蛋白。同時測得軟棗獼猴桃多糖-Ⅱ的分子質量為83733D。

軟棗獼猴桃；多糖；分離純化；柱層析；紫外光譜；分子質量測定

軟棗獼猴桃(Actinidia argutaSieb.et Zucc.)，又名軟棗子，屬于獼猴桃科(Actinidiaceae)、獼猴桃屬(Actinidia)多年生落葉藤本植物[1]。軟棗獼猴桃從東北到長江流域均有分布，長白山脈資源豐富[2]。軟棗獼猴桃果實中VC含量更是高于普通水果數(shù)倍之多，同時從軟棗獼猴桃果實中測得17種氨基酸[3-5]。軟棗獼猴桃具有抗衰老和滋補強壯作用，同時還有提高機體免疫力、抗氧化、防治心腦血管疾病等生理功能[6-7]。多糖又稱多聚糖，是構成生命活動的四大基本物質之一，與生命的多種生理功能密切相關[8]。多糖有免疫調(diào)節(jié)、抗癌、降血糖、降膽固醇、降血脂等生理功能[9-11]。軟棗獼猴桃中富含多糖類物質，對軟棗獼猴桃多糖的研究對軟棗獼猴桃的開發(fā)利用有重要意義。本實驗對通過水提醇沉法提取，Sevag法脫蛋白得到的軟棗獼猴桃多糖的分離純化條件進行優(yōu)化，并選擇最優(yōu)條件對軟棗獼猴桃粗多糖進行分離純化，得到均一純品軟棗獼猴桃多糖。同時對軟棗獼猴桃多糖分子質量進行測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

軟棗獼猴桃果實采自遼寧省海城市九龍川自然保護區(qū)。

無水乙醇、丙酮、無水乙醚、石油醚、三氯甲烷、正丁醇、氯化鈉、苯酚、硫酸、DEAE-纖維素 52、藍葡聚糖2000 國藥集團化學試劑有限公司；Sephadex G-75 SBH-Bio公司；Sephadex G-100、Sephadex G-200 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

5805高速冷凍離心機 德國Investment公司；LL3000凍干機 丹麥Heto公司；JY99-Ⅱ超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-52旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；BS-100A自動部份收集器 上海滬西分析儀器廠；U2910紫外分光光度計 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 軟棗獼猴桃多糖的提取

采用水提醇沉法提取軟棗獼猴桃多糖：將軟棗獼猴桃果實洗凈勻漿，加入體積分數(shù)80%乙醇于80℃水浴除雜[12]，離心；沉淀加蒸餾水于100℃水浴提取2h，離心；上清液濃縮至50mL，濃縮物用90%乙醇沉淀4h，過濾；濾渣用無水乙醇、丙酮、無水乙醚淋洗，過濾，沉淀冷凍干燥，得到軟棗獼猴桃粗多糖。在50℃條件下，用石油醚索氏提取5h對粗多糖進行脫脂[13]；采用Sevag法[14]脫蛋白得到脫蛋白多糖水溶液。

1.3.2 軟棗獼猴桃多糖的分離純化

1.3.2.1 軟棗獼猴桃多糖的初步分離

采用DEAE-纖維素 52離子交換柱層析法對軟棗獼猴桃粗多糖進行初步分離[15-16]：配制10g/L脫蛋白多糖溶液5mL，加到已平衡好的DEAE-纖維素 52柱內(nèi)，分別用蒸餾水和0.1、0.2、0.3mol/L NaCl梯度洗脫。洗脫劑流速為2mL/min，4min/管，分部收集，洗脫液用苯酚-硫酸法[17]檢測繪制洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線收集各均一組分。透析，濃縮，凍干，得半純品軟棗獼猴桃多糖。

1.3.2.2 軟棗獼猴桃多糖組分的進一步分離

采用葡聚糖凝膠柱層析對軟棗獼猴桃多糖組分進行進一步分離[18-19]，分別選擇不同型號的葡聚糖凝膠、層析柱以及不同的樣品質量濃度進行分離，以確定最佳分離條件。繪制洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線收集各均一組分。透析、濃縮、凍干，得純品軟棗獼猴桃多糖。

1.3.3 軟棗獼猴桃多糖的純度鑒定

1.3.3.1 Sephadex G-200純度鑒定[20]

將軟棗獼猴桃多糖亞組分復溶，用相應洗脫劑洗脫，進行Sephadex G-200柱層析，洗脫劑流速為2mL/min，4min/管，分部收集，洗脫液用苯酚-硫酸法檢測繪制洗脫曲線。

1.3.3.2 紫外光譜純度鑒定[14]

將軟棗獼猴桃多糖亞組分復溶，配制成質量濃度為0.05g/L的溶液，在紫外分光光度計上從200～400nm進行波長掃描，蒸餾水作空白對照，檢測有無核酸(波長260nm處)和蛋白質(波長280nm處)的特征吸收峰。

1.3.4 軟棗獼猴桃多糖分子質量的測定

用0.1mol/L NaCl平衡葡聚糖凝膠G-200層析柱(1.1cm×100cm)，洗脫劑流速為2mL/min，4min/管。將2mL 2mg/mL藍葡聚糖2000加入柱內(nèi)定外水體積(Vo)，洗脫液在波長615nm處直接測吸光度。用分子質量分別為T500、T70、T40、T10的標準品相繼上柱，洗脫液用苯酚-硫酸法檢測，分別得到它們的洗脫體積Ve。以分子質量(Mw)的對數(shù)lgMw為縱坐標，Ve/Vo為橫坐標作圖，繪制標準曲線。樣品按上述條件上柱，求得其Ve，根據(jù)Ve/Vo值從標準曲線上求得樣品對應的分子質量。

2 結果與分析

2.1 軟棗獼猴桃多糖的初步分離結果

圖1 軟棗獼猴桃多糖DEAE-纖維素52離子交換柱層析結果Fig.1 Elution profile of crude polysaccharides extracted from Actinidia arguta Sieb. et Zucc. fruits on DEAE-cellulose-52 ion exchange column

由圖1可知，DEAE-纖維素 52離子交換柱層析對軟棗獼猴桃多糖有良好的分離效果。洗脫得到4個明顯洗脫峰，其中，軟棗獼猴桃多糖-Ⅰ為蒸餾水洗脫產(chǎn)物；軟棗獼猴桃多糖-Ⅱ和軟棗獼猴桃多糖-Ⅲ為0.2mol/L NaCl洗脫產(chǎn)物，該洗脫劑洗脫出的兩種多糖組分沒有完全分離，需進一步分離純化；軟棗獼猴桃多糖-Ⅳ為0.3mol/L NaCl洗脫產(chǎn)物。其中，軟棗獼猴桃多糖-Ⅱ為主要組分，后續(xù)實驗對其進行進一步分離，并以該組分為研究對象。

2.2 軟棗獼猴桃多糖組分的進一步分離結果

2.2.1 葡聚糖凝膠型號對軟棗獼猴桃多糖組分分離的影響

將0.2mol/L NaCl洗脫產(chǎn)物復溶，配制成10g/L多糖水溶液，分別選用Sephadex G-75、Sephadex G-100、Sephadex G-200對軟棗獼猴桃多糖進行葡聚糖凝膠柱層析，柱型選擇為D1.1cm×100cm，用0.2mol/L NaCl溶液洗脫。洗脫劑流速為2mL/min，4min/管，分部收集，洗脫液用苯酚-硫酸法檢測繪制洗脫曲線，以選擇分離效果最好的葡聚糖凝膠。葡聚糖凝膠型號對多糖組分分離的影響如圖2所示。

圖2 軟棗獼猴桃多糖Sephadex G-75(a)、Sephadex G-100(b)、Sephadex G-200(c)柱層析結果Fig.2 Separation profiles of mixed fractions Ⅱ and Ⅲ on Sephadex G-75 (a), Sephadex G-100(b) and Sephadex G-200 (c) cellulose columns

由圖2可知，軟棗獼猴桃多糖-Ⅱ和軟棗獼猴桃多糖-Ⅲ組分經(jīng)Sephadex G-75柱層析并沒有完全分離，無法收集兩組分；經(jīng)Sephadex G-100柱層析后，軟棗獼猴桃多糖-Ⅱ和軟棗獼猴桃多糖-Ⅲ組分基本分離，但兩組分交界處沒有完全分離，無法準確收集兩組分；經(jīng)Sephadex G-200柱層析后，軟棗獼猴桃多糖-Ⅱ和軟棗獼猴桃多糖-Ⅲ組分完全分離，可分別收集兩組分。綜上所述，Sephadex G-200對軟棗獼猴桃多糖組分的分離效果最好，因此，選用Sephadex G-200對軟棗獼猴桃多糖進行分離純化。

2.2.2 凝膠柱型號對軟棗獼猴桃多糖組分分離的影響

將0.2mol/L NaCl洗脫產(chǎn)物復溶，配制成10g/L多糖水溶液，分別選用柱型為D1.6cm×50cm、D1.1cm×100cm的層析柱對軟棗獼猴桃多糖進行Sephadex G-200凝膠柱層析，用0.2mol/L NaCl為洗脫劑。洗脫劑流速為2mL/min，4min/管，分部收集，洗脫液用苯酚-硫酸法檢測繪制洗脫曲線，以選擇分離效果最好的層析柱。柱型為D1.6cm×50cm的層析柱對多糖組分分離的影響如圖3所示，柱型為D1.1cm×100cm的層析柱對多糖組分分離的影響如圖2c所示。

圖3 軟棗獼猴桃多糖Sephadex G-200(1.6cm×50cm)層析柱層析結果Fig.3 Separation profile of mixed fractions Ⅱ and Ⅲ on Sephadex G-200 cellulose column (D1.6 cm× 50 cm)

由圖3可知，軟棗獼猴桃多糖-Ⅱ和軟棗獼猴桃多糖-Ⅲ組分經(jīng)柱型為D1.6cm×50cm的層析柱層析并沒有完全分離，無法分別收集兩個組分；由圖2c可知，由于D1.1cm×100cm的層析柱較為細長，軟棗獼猴桃多糖-Ⅱ和軟棗獼猴桃多糖-Ⅲ組分有足夠的空間進行分離，可分別收集兩組分。因此，選用分離效果較好的D1.1cm×100cm層析柱對軟棗獼猴桃多糖進行分離純化。

2.2.3 多糖質量濃度對軟棗獼猴桃多糖組分分離的影響將0.2mol/L NaCl洗脫產(chǎn)物復溶，分別配制成質量濃度為5、10、20g/L的多糖水溶液，采用Sephadex G-200對該產(chǎn)物進行葡聚糖凝膠柱層析，柱型選擇為D1.1cm×100cm，用0.2mol/L NaCl進行洗脫。洗脫劑流速為2mL/min，4min/管，分部收集，洗脫液用苯酚-硫酸法檢測繪制洗脫曲線，以選擇分離效果最好的多糖濃度。多糖質量濃度為5g/L及20g/L對多糖組分分離的影響如圖4所示，多糖質量濃度為10g/L對多糖組分分離的影響如圖2c所示。

圖4 多糖質量濃度為5g/L(a)和20g/L(b)柱層析結果Fig.4 Separation profiles of mixed fractions Ⅱ and Ⅲ at different initial polysaccharide concentrations on Sephadex G-200 cellulose column (D1.1 cm × 100 cm)

由圖4a可知，當多糖質量濃度為5g/L時，軟棗獼猴桃多糖-Ⅱ和軟棗獼猴桃多糖-Ⅲ組分基本分離，但由于上樣質量濃度較小，每種組分的含量較少，若以此質量濃度為分離的最終質量濃度，則分離效率較低。由圖4b可知，當多糖質量濃度為20g/L時，由于上樣質量濃度較大，軟棗獼猴桃多糖-Ⅱ和軟棗獼猴桃多糖-Ⅲ組分分離效果不明顯，無法獲得單一組分。由圖2c可知，當多糖質量濃度為10g/L時，上樣質量濃度適中，軟棗獼猴桃多糖-Ⅱ和軟棗獼猴桃多糖-Ⅲ組分完全分離，可以收集單一組分。因此，選擇質量濃度為10g/L的多糖濃度進行分離。

綜上所述，軟棗獼猴桃多糖-Ⅱ和軟棗獼猴桃多糖-Ⅲ組分的最佳分離條件為葡聚糖凝膠型號為Sephadex G-200，層析柱型號為D1.1cm×100cm，多糖質量濃度為10g/L。以此條件對軟棗獼猴桃多糖-Ⅱ和軟棗獼猴桃多糖-Ⅲ組分進行分離結果如圖2c所示，軟棗獼猴桃多糖-Ⅱ組分為主要組分，根據(jù)洗脫曲線收集軟棗獼猴桃多糖-Ⅱ組分。透析，濃縮，凍干，得純品軟棗獼猴桃多糖-Ⅱ。

2.3 軟棗獼猴桃多糖的純度鑒定

2.3.1 Sephadex G-200純度鑒定

圖5 Sephadex G-200純度鑒定結果Fig.5 Elution profile of purified fraction Ⅱ on Sephadex G-200 cellulose column

由圖5可知，軟棗獼猴桃多糖-Ⅱ組分經(jīng)Sephadex G-200凝膠柱層析后，得到了一個單一對稱窄峰。說明通過分離純化得到的軟棗獼猴桃多糖-Ⅱ是均一的純多糖，可以進行后續(xù)實驗研究。

2.3.2 紫外光譜純度鑒定

圖6 紫外光譜純度鑒定結果Fig.6 UV absorption spectrum of purified fraction Ⅱ

由圖6紫外光譜可知，軟棗獼猴桃多糖-Ⅱ組分在260、280nm波長處均無吸收峰，表明軟棗獼猴桃多糖-Ⅱ組分不含核酸及蛋白。

2.4 分子質量的測定

圖7 多糖分子質量測定的標準曲線Fig.7 Calibration curve of standard dextrans for determining the molecular weight of purified fraction Ⅱ

由圖7可知，經(jīng)過Sephadex G-200柱層析，測得軟棗獼猴桃多糖-Ⅱ的洗脫體積Ve為96mL，根據(jù)Ve/Vo值從標準曲線上求得軟棗獼猴桃多糖-Ⅱ的分子質量為83733D。

3 結 論

利用DEAE-纖維素 52離子交換柱層析得到4種軟棗獼猴桃多糖組分；選用Sephadex G-100、層析柱規(guī)格為D1.1cm×100cm，多糖質量濃度為10g/L的條件對軟棗獼猴桃多糖組分進一步分離，得到含量較高的軟棗獼猴桃多糖-Ⅱ純品。通過Sephadex G-200凝膠柱層析鑒定軟棗獼猴桃多糖-Ⅱ是均一的純多糖，通過紫外光譜鑒定軟棗獼猴桃多糖-Ⅱ不含核酸及蛋白。同時測得軟棗獼猴桃多糖-Ⅱ的分子質量為83733D。

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Isolation, Purification and Molecular Weight Determination of Polysaccharides fromActinidia argutaSieb. et Zucc. Fruits

PAN Song，LIU Chang-jiang*，LIANG Shuang
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Polysaccharides fromActinidia argutaSieb. et Zucc. were extracted by hot-water extraction, ethanol precipitation,protein removal by the Sevag method and then purified by DEAE-cellulose-52 ion exchange column chromatography. Four polysaccharide fractions were obtained. The best purification of Fraction Ⅱ was achieved by chromatographic separation on a Sephadex G-200 column (D1.1 cm × 100 cm) at a sample concentration of 10 g/L. As a result, a homogenous pure polysaccharide was obtained. The results of UV spectroscopic analysis revealed that the purified polysaccharide contained neither proteins nor nucleic acids. Moreover, the molecular weight of the purified polysaccharide was measured to be 83733 D.

Actinidia argutaSieb. et Zucc.；polysaccharide；isolation and purification；column chromatography；ultraviolet spectroscopy；molecular weight determination

Q539

A

1002-6630(2012)15-0066-05

2011-07-09

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(200903013)

潘松(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：zcqpslove@163.com

*通信作者：劉長江(1955—)，男，教授，碩士，研究方向為食品生物技術。E-mail：liucj597@sohu.com