纖維素酶-微波輔助提取軟棗獼猴桃莖黃酮的工藝優(yōu)化

張春紅，許 寧，吳 雙，劉長(zhǎng)江*

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866)

纖維素酶-微波輔助提取軟棗獼猴桃莖黃酮的工藝優(yōu)化

張春紅，許 寧，吳 雙，劉長(zhǎng)江*

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866)

采用纖維素酶-微波輔助法提取軟棗獼猴桃莖中的黃酮類物質(zhì)。通過(guò)單因素試驗(yàn)確定纖維素酶的添加量、酶解時(shí)間、作用溫度、pH值的適宜水平，在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法，通過(guò)方差分析建立數(shù)學(xué)模型，得到軟棗獼猴桃莖黃酮提取的最佳工藝條件：纖維素酶添加量438U/g、酶解時(shí)間64min、作用溫度49℃、pH4.7，在此條件下軟棗獼猴桃莖黃酮提取率為2.89%。

軟棗獼猴桃莖；黃酮類物質(zhì)；纖維素酶；微波；響應(yīng)面分析

軟棗獼猴桃(Actinidia arguta Sieb．et Zucc．)，又名軟棗子、獼猴梨、藤瓜，屬于獼猴桃科(Actinidiaceae)、獼猴桃屬(Actinidia)多年生落葉藤本植物[1]。國(guó)外研究表明，軟棗獼猴桃莖中含有豐富的黃酮類化合物，特別是其中的(＋)-兒茶素和(-)-表兒茶素具有促進(jìn)骨髓細(xì)胞增殖的功能活性[2]。在冬季，軟棗獼猴桃的枝條被修剪下來(lái)，很多枝條被拋棄在田間地頭，造成了資源的浪費(fèi)。現(xiàn)代藥理研究表明，黃酮類化合物具有多種生物活性[3-6]，如清除自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抗病毒、防衰老、抗癌、保肝護(hù)肝及防治糖尿病等作用。因此，從軟棗獼猴桃莖中提取黃酮類化合物作為功能性食品或藥品的原料具有較好的開(kāi)發(fā)前景。

在國(guó)內(nèi)對(duì)軟棗獼猴桃莖中黃酮類化合物的提取尚沒(méi)有較成熟的方法，而如有機(jī)溶劑浸提和熱水提取等傳統(tǒng)法不能將被包裹在植物細(xì)胞壁組織中的有效成分完全的提取出來(lái)。細(xì)胞壁的主要成分是纖維素，纖維素酶能使細(xì)胞壁疏松、破裂，減少傳質(zhì)阻力，從而提高提取效率[7]。在國(guó)內(nèi)外對(duì)植物原料活性成分的提取方法中，微波輔助法已被廣泛采用，可以降低能源消耗，節(jié)省提取時(shí)間，并且生產(chǎn)設(shè)備簡(jiǎn)單無(wú)污染[8-9]。為了充分利用軟棗獼猴桃資源，本研究采用酶法與微波輔助法相結(jié)合，從軟棗獼猴桃莖中提取黃酮類化合物，并確定最佳提取工藝條件，為今后軟棗獼猴桃莖黃酮類化合物的開(kāi)發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

軟棗獼猴桃莖產(chǎn)自遼寧省本溪市；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(分析純) 上海源葉生物科技有限公司；纖維素酶(酶比活力≥15000.0U/g) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

U291型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；HD-5型電腦紫外檢測(cè)儀 上海滬西分析儀器廠；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；5805型高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Investment公司；PB-10型數(shù)顯pH計(jì) 德國(guó)Sartorius公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司；YP1002N電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀；DHG-90240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；MAS-I型微波爐 上海新儀微波化學(xué)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 總黃酮含量的測(cè)定

采用 Al(NO3)3-NaNO2法[10-11]。

1.3.2 脂肪、色素等雜質(zhì)的脫除。

采用索氏提取法。

1.3.3 軟棗獼猴桃莖樣粉的制備

將軟棗獼猴桃鮮莖洗凈，剪成段，在40℃條件下烘干，粉碎，經(jīng)石油醚脫脂脫色后烘干至無(wú)殘留，得到軟棗獼猴桃莖樣粉，至低溫避光處保存，一周內(nèi)備用。

1.3.4 纖維素酶-微波提取工藝

稱取1.00g樣粉于錐形瓶中，加入10mL一定pH值的磷酸緩沖溶液和定量的纖維素酶，于指定溫度下水浴酶解至相應(yīng)時(shí)間后于沸水浴滅酶5min， 加入無(wú)水乙醇使其體積分?jǐn)?shù)為70%，在料液比為1:32(g/mL)、微波功率300W的條件下，提取時(shí)間5min(每間隔1min微波1次，每次作用1min)。微波處理后所得浸提液稍冷卻，然后在4℃條件下6000r/min離心10min，過(guò)濾，去除濾渣，所得濾液減壓濃縮，再用體積分?jǐn)?shù)6 0%乙醇定容至100mL容量瓶，所得樣液待測(cè)[12-14]。

1.3.5 軟棗獼猴桃莖黃酮提取率計(jì)算方法

取不同試驗(yàn)條件下所得的定容樣液按Al(NO3)3-NaNO2法測(cè)定，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在510nm處比色，得吸光度，以A510表示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣液黃酮質(zhì)量濃度，按下式計(jì)算黃酮提取率：

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析

每組單因素試驗(yàn)重復(fù)3次。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Minitab軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)及和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

采用Al(NO3)3-NaNO2法，精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5mg，放于25mL容量瓶中，溶于體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液中，定溶至刻度，配成0.2mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取0、1、2、3、4、5、6mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于25mL容量瓶中，以蒸餾水補(bǔ)足至6mL，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%亞硝酸鈉溶液1mL，放置6min；加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硝酸鋁溶液1mL，放置6min；再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%氫氧化鈉溶液10mL，體積分?jǐn)?shù)60%乙醇定容，搖勻，放置15min，于510nm下測(cè)定吸光度，以蘆丁質(zhì)量濃度x/(μg/mL)為橫軸，以吸光度(A)為縱軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1，得回歸方程為A＝0.0083x＋0.0052，R2＝0.9992。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 纖維素酶添加量對(duì)黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取6份1.00g軟棗獼猴桃莖樣粉，加入10mL pH4.0的磷酸緩沖液，分別按每克樣粉100～600U的纖維素酶作為作用酶，于45℃作用1h，沸水浴滅酶后微波輔助提取，測(cè)定其中黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算提取率，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 加酶量對(duì)黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of cellulose concentration on extraction rate of flavonoids

由圖2可知，隨著纖維素酶的添加量的增加，軟棗獼猴桃莖黃酮的提取率增大，當(dāng)加酶量達(dá)到400U/g后，黃酮的提取率隨著加酶量的增加沒(méi)有明顯提高，綜合經(jīng)濟(jì)因素考慮，選擇酶的添加量為400U/g時(shí)為適宜的酶的添加量。

2.2.2 pH值和作用溫度對(duì)黃酮提取率的影響

其余條件同2.2.1節(jié)，每份軟棗獼猴桃莖樣粉添加400U/g的纖維酶，研究不同pH值對(duì)黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 pH值對(duì)黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of pH on extraction rate of flavonoids

由圖3可知，pH值和作用溫度對(duì)軟棗獼猴桃莖中黃酮提取率有明顯影響。當(dāng)pH值由3.5升到4.5時(shí)，黃酮的提取率迅速增大，而當(dāng)pH值斷續(xù)增大時(shí)，黃酮提取率反而開(kāi)始下降，分析原因是每種酶類物質(zhì)都有其最適的作用pH值，當(dāng)pH值為4.5時(shí)，處于纖維素酶的最佳作用pH值區(qū)間(4.0～6.0)里，能夠發(fā)揮纖維素酶的最大活力，使之最大限度作用于細(xì)胞壁纖維素；因此，纖維素酶在pH 4.5時(shí)酶解的效果較好。

2.2.3 作用溫度對(duì)黃酮提取率的影響

其余條件同2.2.2節(jié)，在pH4.5的條件下，研究不同溫度對(duì)黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 作用溫度對(duì)黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on extraction rate of flavonoids

由圖4可知，隨著作用溫度的提高，軟棗獼猴桃莖黃酮提取率逐漸增大，但當(dāng)溫度高于50℃后，其提取率開(kāi)始下降，這是因?yàn)楫?dāng)溫度上升到50℃時(shí)，纖維素酶達(dá)到了最適的作用溫度，而溫度再高則使蛋白質(zhì)變性，從而影響了酶的活性[10]。

2.2.4 酶解時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

其余條件同2.2.3節(jié)，研究50℃條件下，不同酶解時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on extraction rate of flavonoids

由圖5可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，軟棗獼猴桃莖黃酮的提取率在不斷的提高，但是60min后，黃酮的提取率趨于穩(wěn)定，沒(méi)有顯著的變化，因此從節(jié)省時(shí)間，降低成本的角度考慮，60～80min為適宜的提取時(shí)間。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)[8]，并以上述四個(gè)因素為自變量，軟棗獼猴桃莖黃酮提取率(Y)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了四因素三水平共27個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其因素水平編碼值見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平編碼值Table 1 Coded values and corresponding real values of the optimization parameters tested in response surface analysis

將表2所得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Minitab統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行回歸分析，四個(gè)因素經(jīng)過(guò)擬合得到以黃酮提取率(Y)為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程：

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results for response surface analysis

表3 回歸系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)Table 3 Regression coefficients and their significance in the fitted regression model

由表3可看出，作用溫度對(duì)提取率影響顯著(P＜0.05)，纖維素酶的添加量、酶解時(shí)間和pH值對(duì)黃酮類化合物的提取率影響極顯著(P＜0.001)。響應(yīng)回歸模型(P＜0.001)，達(dá)到了極顯著水平，說(shuō)明該方程能夠正確反映軟棗獼猴桃莖黃酮提取率與各因素之間的關(guān)系。失擬項(xiàng)P＝0.516＞0.05，不顯著，說(shuō)明本試驗(yàn)無(wú)其他因素的顯著影響，方程對(duì)試驗(yàn)擬合良好，試驗(yàn)誤差小。相關(guān)系數(shù)R2＝0.9814，表明有98.14%的數(shù)據(jù)可以用此回歸模型來(lái)解釋。

2.3.2 響應(yīng)面分析

利用Minitab軟件即可以作出兩因素交互作用的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖，見(jiàn)圖6。

圖6 各因素交互作用對(duì)黃酮提取率的影響Fig.6 Response surface and contour plots for the effects of cellulose dose, extraction temperature and bydrolysis time on extraction rate of flavonoids

從圖6A可以看出，等高線沿纖維素酶的添加量軸向變化較作用溫度軸向變化相對(duì)密集，曲面較陡，說(shuō)明纖維素酶的添加量對(duì)黃酮提取率的影響較顯著，并且在纖維素酶的添加量為300～400U/g時(shí)，黃酮的提取率受影響較敏感。從圖6B可以看出，等高線沿酶解時(shí)間軸向變化相對(duì)密集，而沿作用溫度軸向變化相對(duì)稀疏，說(shuō)明在酶解時(shí)間與作用溫度交互作用的情況下，酶解時(shí)間較作用溫度對(duì)響應(yīng)值的影響較大，隨著酶解時(shí)間和作用溫度的增大，黃酮的提取率先快速提高后又緩慢降低。從圖6C可以看出，在pH值較大范圍內(nèi)均可以得到較大的響應(yīng)值，等高線沿pH值軸向變化密集程度略大于作用溫度軸向方向，說(shuō)明在pH值對(duì)響應(yīng)值的影響比作用溫度影響顯著。從圖6可以看出，三組交互作用的等高線圖都呈橢圓形，說(shuō)明以上三組交互作用都很強(qiáng)，影響顯著，圖6A曲面最陡，說(shuō)明纖維素酶的添加量與溫度的交互作用對(duì)黃酮提取率的影響最顯著。

2.2.3 最佳工藝條件的確定

通過(guò)軟件Minitab分析，得出最優(yōu)的提取工藝條件為纖維素酶的添加量438.38U/g、酶解時(shí)間63.83min、作用溫度49.44℃、pH4.74，此時(shí)軟棗獼猴桃莖黃酮的提取率達(dá)到極值為2.91%。為檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，考慮實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)條件，采用纖維素酶的添加量438U/g、酶解時(shí)間64min、作用溫度49℃、pH4.7的修正條件進(jìn)行平行試驗(yàn)，結(jié)果得出軟棗獼猴桃莖黃酮的實(shí)際提取率為2.89%，與理論預(yù)測(cè)值基本吻合，因此，響應(yīng)面模型具有可行性。

3 結(jié) 論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)纖維素酶-微波輔助法提取軟棗獼猴桃莖黃酮類化合物的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，研究發(fā)現(xiàn)作用溫度對(duì)提取率影響顯著，纖維素酶的添加量、酶解時(shí)間和pH值對(duì)黃酮類化合物的提取率影響極顯著；在因素交互作用中，纖維素酶的添加量與溫度的交互作用最顯著。優(yōu)化后的最佳工藝條件為纖維素酶的添加量438U/g、酶解時(shí)間64min、作用溫度49℃、pH4.7，此條件下軟棗獼猴桃莖黃酮提取率為2.89%。

[1] 樸一龍, 趙蘭花. 軟棗獼猴桃研究進(jìn)展[J]. 北方園藝, 2008(3): 76-78.

[2] TAKANO F, TANAKA T, TSUKAMOTO W, et al. Isolation of (＋)-catenin and (-)-epicatenin from Actinidia arguta as bone marrow cell proliferation promoting compounds[J]. Planta Med, 2003, 69 (4): 321-326.

[3] 曾佑煒, 趙金蓮, 彭永宏. 黃酮的吸收和代謝研究進(jìn)展[J]. 中草藥,2008, 39(3): 460-464.

[4] CHOISANG W. Antioxidative activity of flavonoids in persinmon leaves[J]. Food and Biotechnololgy, 1996, 5(2): 119-123.

[5] HABTEMARIAM S. Flavonoids as inhibitors or enhancers of the cytotoxi city of tum or Necris is factwrain L～929 tum or cells[J]. Journal of Natural Products, 1997, 60(8): 775-778.

[6] HU Changqi, CHEN Ke, SHI Qian, et al. Anti-AID sagents, 10, acacetin 7-O-β-D-galactopyranoside, an anti-HIV principle from chrysanthemum morifolivm and a structure activity correlation with some related flavonoids[J]. Journal of Natural Products, 1994, 57(1): 42-51.

[7] 劉曉光, 毛波, 胡立新. 酶解法提取山楂黃酮的工藝[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā), 2010, 31(8): 56-59.

[8] PAN Xuejun, LIU Huizhou, JIA Guanghe, et al. Microwave-assisted extraction of glycyrrhizic acid from licorice root[J]. Biochemical Engineering Journal, 2002, 5(7): 173-177.

[9] 馬長(zhǎng)雨, 楊悅武, 郭治昕, 等. 微波萃取在中藥提取和分析中的應(yīng)用[J]. 中草藥, 2004, 35(11): 附 7-附 9.

[10] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社,2000: 553.

[11] 孫寧寧. 長(zhǎng)白山野生軟棗稱猴桃的成分分析及保鮮研究[D]. 長(zhǎng)春: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.

[12] 曾柏全, 周小芹, 解西玉. 纖維素酶-微波法提取臍橙皮橙皮苷工藝優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(4): 85-89

[13] 姜國(guó)芳, 王小東, 朱霞萍, 等. 南瓜莖黃酮及多糖的微波輔助聯(lián)合提取工藝[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2009, 35(7): 171-173.

[14] 姚超, 于海寧, 阮暉, 等. 酶解結(jié)合超聲波輔助技術(shù)提取純化菊米總黃酮[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(6): 48-51.

[15] 楊文雄, 高彥祥. 響應(yīng)面法及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)食品添加劑, 2005(2): 68-71.

Optimization of Cellulase Pretreatment for Microwave-Assisted Extraction of Flavonoids from Actinidia arguta Stem

ZHANG Chun-hong，XU Ning，WU Shuang，LIU Chang-jiang*
(College of Food, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Cellulase pretreatment before microwave-assisted extraction of flavonoids from Actinidia arguta stem was optimized by response surface methodology. One-factor-at-a-time experiments were performed to select appropriate levels of enzyme dose, hydrolysis time, temperature and pH. Further, a mathematical model was built and subjected to variance analysis. The optimal cellulase hydrolysis conditions were determined as follows: the optimal enzyme dose was 438 U/g for 64 min of hydrolysis at 49 ℃ and pH 4.7. Under these conditions, the extraction rate of flavonoids was up to 2.89%.

Actinidia arguta stem；flavonids；cellulose；microwave；response surface methodology

R284.2

A

1002-6630(2012)08-0024-05

2011-04-11

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(200903013)

張春紅(1968—)，女，副教授，博士，主要從事植物蛋白質(zhì)、酶工程研究。E-mail：helloxuning@sina.com

*通信作者：劉長(zhǎng)江(1955—)，男，教授，博士，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：liucj597@sohu.com