二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計優(yōu)化藥桑花青素提取工藝

楊 松，周蓓蓓，程江華，鄔德軒，丁之恩,*，閆曉明,*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，安徽 合肥 230031)

二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計優(yōu)化藥桑花青素提取工藝

楊 松1,2，周蓓蓓2，程江華2，鄔德軒1，丁之恩1,*，閆曉明2,*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，安徽 合肥 230031)

在超聲波輔助條件下，采用四元二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、時間、溫度4個因素對藥桑花青素提取效率的影響，用DPS7.05軟件分析得出4個因素的回歸方程。結(jié)果表明，超聲波輔助提取最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍52.46%～55.93%、提取液料比范圍39.51:1～42.43:1(mL/g)、提取時間范圍27.77～32.23min、提取溫度范圍50.18～52.4℃，在此工藝條件下花青素提取效率均能達(dá)到67%以上。

藥桑；花青素；正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計；提取；優(yōu)化

新疆藥桑屬于半栽種的野生桑資源，藥桑在植物學(xué)分類上屬桑科，桑屬，黑桑種(Morus nigra Linn.)，新疆藥桑是我國唯一的黑桑種，也是一種在自然界極其罕見的具有22組染色體的22倍體桑樹種質(zhì)資源[1-2]。藥桑作為珍稀的藥食兼用桑屬品種資源，近年來引起了國內(nèi)外桑樹學(xué)科以及藥學(xué)、營養(yǎng)學(xué)專家的廣泛關(guān)注，開展了對藥桑生物活性成分及藥理作用的相關(guān)研究[3-5]。

合成色素穩(wěn)定性高，著色力強且成本低廉，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)很多曾允許使用的人工合成食用色素對人體造成程度不一的損害。而天然色素具有安全、無毒、資源豐富的優(yōu)點，并具有一定營養(yǎng)和藥理作用，故天然色素市場日益擴大[6]。花青素是天然色素中應(yīng)用極其廣泛的一類色素，屬于多酚類化合物。花青素不但色澤鮮亮，還具有很強的抗氧化活性，能夠減少冠心病、癌癥和腦血管疾病的發(fā)病機率[7-9]。因此，優(yōu)化花青素提取工藝，對花青素產(chǎn)品的開發(fā)具有重要的意義。

二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計是正交回歸試驗設(shè)計的一種，它既能分析各處理因子的影響，又能建立定量的數(shù)學(xué)模型，屬更高級的試驗設(shè)計技術(shù)[10-11]。

本研究在對6個提取條件進(jìn)行單因素考察基礎(chǔ)上，采用二次正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計法優(yōu)化花青素提取工藝參數(shù)，提高花青素提取率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑椹：新疆藥桑品種，新疆維吾爾自治區(qū)和田蠶桑科學(xué)研究所提供。

無水乙醇、濃鹽酸、氯化鉀、醋酸鈉均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SP-75紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；FS-450超聲波處理器 上海生析超聲儀器有限公司；真空干燥箱 上海實驗儀器總廠；DFT-100多功能中藥粉碎機 溫嶺市大德中藥機械有限公司；FA2104電子天平 海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；FD-1CE真空冷凍干燥機 北京德天佑科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑椹花青素提取流程

1.3.2 桑椹花青素含量測定及提取率計算[12-15]

桑椹干粉中花青素含量的測定：精確稱取2.000g桑椹干粉，置于錐形瓶中，加入80mL酸性乙醇在超聲波輔助條件下提取，重復(fù)提取數(shù)次，直至提取液無色，提取液按pH示差法測定桑椹干粉花青素含量。

pH示差法操作如下：準(zhǔn)確移取2份1mL待測提取液分別置于10mL離心管中，再分別加入8mL pH1.0和pH4.5的緩沖液于離心管中。達(dá)平衡后，分別在520nm和700nm波長處測定吸光度。花青素含量計算公式如下：

式中：ΔA為吸光度差，ΔA＝(A520nm,pH1.0－A700nm,pH1.0)－(A520nm,pH4.5－A700nm,pH4.5)；ε為矢車菊花素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，26900(L/(mol·cm))；DF為稀釋倍數(shù)；MW為矢車菊花素-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量，449.2g/moL；L為光程，1c m。

1.3.3 單因素試驗

精確稱取1.000g桑椹干粉，加入一定體積的提取試劑。按不同的試驗設(shè)計條件提取花青素，對提取溶液、提取液體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時間、提取液料比和超聲波功率進(jìn)行單因素試驗，重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4 二次正交旋轉(zhuǎn)試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇合適的單因素，設(shè)計4因素4水平的二次正交旋轉(zhuǎn)試驗，以提取率為考察指標(biāo)，確定最優(yōu)提取工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取試劑對花青素提取率的影響

圖1 提取試劑對提取率的影響Fig.1 Effect of extraction solvent type on extraction efficiency

在提取溫度50℃、提取時間30min、液料比30:1(mL/g)、超聲波功率300W條件下，不同提取試劑對提取率的影響。如圖1所示，酸性乙醇的提取效果最好。花青素屬于黃酮類物質(zhì)，根據(jù)“相似相溶”原理，可溶于水、甲醇、乙醇等極性溶劑，并且在與其極性最相近的溶液中溶解性最好。此外，花青素在弱酸性條件下性質(zhì)穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)不易發(fā)生改變，而在中性和弱堿性條件下性質(zhì)相對不穩(wěn)定。因此，本實驗以酸性乙醇作為提取溶劑。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對花青素提取率的影響

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對花青素提取率的影響Fig.2 Effect of alcohol concentration on extraction efficiency

在酸性乙醇為提取試劑(其他條件如2.1.1節(jié))下，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對提取率的影響如由圖2所示，提取率隨著酸性乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大先不斷增高至最高點后降低。當(dāng)酸性乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時，提取率最大。乙醇浸提使花青素溶入乙醇溶液，乙醇溶液的極性隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而變小，當(dāng)溶劑極性和花青素極性最相近時，花青素在溶劑中溶解性最好，則花青素提取率最高。

2.1.3 提取溫度對花青素提取率的影響

圖3 提取溫度對花青素提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

圖3表示不同溫度對花青素提取率的影響(50%酸性乙醇為提取試劑，其他條件如2.1.1節(jié))。由圖3可知，溫度較低時，桑椹花青素提取率隨著提取溫度的升高而增長。當(dāng)提取溫度為50℃時，提取率最大。但是繼續(xù)升高溫度后提取率反而下降，這可能與花色苷物質(zhì)耐熱性較差，在高溫下易發(fā)生結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而褪色有關(guān)。因此過高的溫度(＞50℃)會對桑椹花青素的色價及穩(wěn)定性有造成一定影響。而低溫條件(＜50℃)下提取率較低，造成資源的浪費。

2.1.4 超聲波功率對花青素提取率的影響

圖4 超聲波功率對提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction efficiency

圖4表示不同超聲波功率對花青素提取率的影響(50%酸性乙醇為提取試劑，其他條件如2.1.1節(jié))。由圖4可知，超聲波功率在100～500W時，花青素提取率隨著超聲波功率的提高而提高。當(dāng)超聲波功率達(dá)到300W時，繼續(xù)提高超聲波功率，提取率無顯著增長。超聲波的提取機理主要是超聲波在提取溶液中產(chǎn)生的“空化效應(yīng)”和機械作用：超聲波一方面可有效地破碎桑椹的細(xì)胞壁，使花青素呈游離狀態(tài)并溶入乙醇中，另一方面可加速乙醇的分子運動，使乙醇和花青素中快速接觸，相互溶合、混合。當(dāng)超聲波功率較低時，破碎力度不夠，使得花青素不能快速的融入乙醇中，所以提取率較低。但超聲波功率過高時，環(huán)境噪音過大，且提取率沒有顯著提高，因此，考慮節(jié)能環(huán)保等因素，故選用300W作為提取功率。

2.1.5 提取時間對花青素提取率的影響

圖5 提取時間對提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction efficiency

圖5表示不同的提取時間對花青素提取率的影響(50%酸性乙醇為提取試劑，其他條件如2.1.1節(jié))。從圖5可見，提取時間在10～50min時，花青素提取率隨著提取時間的延長先提高后降低。當(dāng)提取時間為20min時，提取率最大。提取時間為10min時，由于提取時間較短導(dǎo)致桑椹細(xì)胞中花青素?zé)o法得到完全的釋放，使得提取效果不理想。但是當(dāng)提取時間超過30min時，由于提取時間過長，導(dǎo)致花青素的結(jié)構(gòu)可能受到超聲作用的破壞而使提取率下降。

2.1.6 液料比對花青素提取率的影響

圖6 液料比對花青素提取率的影響Fig.6 Effect of solid-to-liquid ratio on extraction efficiency

圖6表示在不同的液料比對花青素提取率的影響(50%酸性乙醇為提取試劑，其他條件如2.1.1節(jié))。由圖6可見，液料比在10:1～30:1(mL/g)時，花青素提取率隨著液料比的增加而提高，這與提取液料比過低，桑椹中花青素?zé)o法被乙醇溶液完全浸提出來有關(guān)。在液料比達(dá)到30:1(mL/g)后，花青素提取效率無顯著升高。因此選定30:1(mL/g)為最佳液料比。

2.2 二次正交旋轉(zhuǎn)試驗

2.2.1 二次正交旋轉(zhuǎn)試驗設(shè)計與結(jié)果

表1 二次正交旋轉(zhuǎn)試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal rotation combination design

表2 藥桑花青素提取二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗方案及結(jié)果Table 2 Orthogonal rotation combination design scheme and results

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以花青素提取液中花青素含量為考察目標(biāo)，設(shè)計4因素4水平的二次正交旋轉(zhuǎn)試驗。確定提乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)、提取液料比(X2)、提取時間(X3)、提取溫度(X4)的零水平分別為50%、30:1(mL/g)、30min、50℃，試驗設(shè)計及結(jié)果見表1、2。

2.2.2 回歸模型建立與檢驗

采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對表2中的結(jié)果進(jìn)行二次多項式逐步回歸分析，得到花青素提取效率(Y)和乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取液料比、提取時間和提取溫度的回歸模型：

表3 試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of the experimental results of orthogonal rotation combination design

由表3可見，回歸方程的矢擬性檢驗F1＝0.79616＜F0.05(10,11)＝ 2.85 及 F0.01(10,11)＝ 4.54，F(xiàn)2＝ 6.17132 ＞F0.01(14,21)＝3.07及F0.05(14,21)＝2.20，說明模型的預(yù)測準(zhǔn)確，模型成立，可用于描述花青素提取效率隨提取液料比、提取時間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)變化的規(guī)律。

在α＝0.05顯著水平上剔除不顯著項后，簡化的回歸方程：

2.2.3 主效應(yīng)分析

P值即概率，反映某一事件發(fā)生的可能性大小。各因素的P值可以反映出各因素對試驗指標(biāo)的重要性，P值越小，表明該因素對試驗結(jié)果影響越大，即重要性越大[16]。由表3可見，4個試驗因素對花青素提取率影響大小依次為提取液料比＞提取溫度＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時間。

2.2.4 單因素效應(yīng)分析

將得到的回歸方程中的四個因素任意三個固定在零水平，得：

把4個因子的取值固定在－2、－1.6、－1.2、－0.8、－0.4、0、0.4、0.8、1.2、1.6、2水平，根據(jù)上述方程，計算出各因子在11個不同水平上花青素提取效率(Y)，并以此作圖，結(jié)果見圖7。

圖7 各單因素與花青素提取效率的關(guān)系Fig.7 Relationship between each variable and extraction efficiency of anthocyanidin

由圖7可見，在各因子處于－2～2這一水平區(qū)間時，提取液料比與花青素提取率的關(guān)系最接近線性條件，表明提取液料比對花青素提取效率的影響最顯著，另外提取液料比的升高有利于花青素提取率的增大。而乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間和提取溫度與花青素提取率的關(guān)系曲線呈拋物線狀，表明這3個因素不能無限制的升高，超過一定范圍便會使花青素提取率降低。尤其是提取溫度的升高會顯著降低花青素提取率。此外，圖7中各因素變化趨勢與前面單因素試驗結(jié)果基本吻合。

2.2.5 提取參數(shù)優(yōu)化

為了得出最佳的提取參數(shù)，通常對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行頻數(shù)分析。選取了提取效率大于67%的155個方案進(jìn)行頻數(shù)分析，得到95%的置信區(qū)間，如表4所示。

由表4可知，花青素提取最佳工藝參數(shù)范圍為：乙醇體積分?jǐn)?shù)52.46%～55.93%、提取液料比39.51:1～42.43:1(mL/g)、提取時間27.77～32.23min、提取溫度50.18～52.4℃，在此參數(shù)范圍內(nèi)，花青素提取效率均大于67%。

表4 各變量取值頻率分布Table 4 Probability distribution of each variable

2.2.6 驗證實驗

從優(yōu)化提取參數(shù)范圍內(nèi)隨機選擇3個組合進(jìn)行驗證實驗，結(jié)果見表5。

表5 驗證實驗結(jié)果Table 5 Results of validation experiments

由表5可見，3次驗證實驗平均理論值為71.66%，平均實際值為71.18%，兩者僅相差0.48%，可見實際值與理論值基本吻合，且均在67%以上。由此可知，采用本實驗的工藝參數(shù)，可獲得67%以上的花青素提取效率。

3 結(jié) 論

根據(jù)二次正交旋轉(zhuǎn)試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，花青素提取效率影響大小的因素依次為提取料液比＞提取溫度＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時間，且花青素提取最佳工藝參數(shù)范圍為乙醇體積分?jǐn)?shù)52.46%～55.93%、提取料液比39.51:1～42.43:1(mL/g)、提取時間27.77～32.23min、提取溫度50.18～52.4℃，在此參數(shù)范圍內(nèi)，花青素提取效率均大于67%。最后進(jìn)行驗證實驗，結(jié)果與預(yù)測值基本吻合。因此本研究為提取桑椹花青素提供了較好的提取方案。

[1] 買買提依明. 新疆藥桑的研究[J]. 北方蠶業(yè), 2007, 28(1):1-3.

[2] 新疆蠶學(xué)會. 新疆桑樹品種志[M]. 烏魯木齊: 新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)業(yè)廳, 1980: 3-7.

[3] 買買提依明, 盧紅, 木合達(dá)爾. 新疆藥桑有效成分測定及藥理作用的研究初報[J]. 北方蠶業(yè), 2006, 27(4): 16-18.

[4] 宋大可, 買買提依明, 乃比江. 新疆藥桑果汁化學(xué)成分及藥物價值的探討[J]. 蠶桑通報, 1994, 25(4): 23-34.

[5] 買買提依明, 徐立, 武春, 等. 新疆藥桑黃酮和多酚的提取與分析研究初探[J]. 北方蠶業(yè), 2008, 29(4):12-14.

[6] BOLIVAR A C, LUIS C Z. Stability of anthocyanin-based aqueous extracts of Andeam purple corn and red-fleshed sweet potato compared to synthetic and natural colorants[J]. Food Chemistry, 2004, 86(1):69-77.

[7] WANG Weidong, XU Shiying. Degradation kinetics of anthoeyanins in blackberry juice and concentrate[J]. Journal of food engineering, 2007,82(3): 271-275.

[8] 呂英華, 蘇平, 那宇. 桑椹色素體外抗氧化能力研究[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報: 農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版, 2007, 33(1): 102-107.

[9] AYSEGUL K, MEHMET O, BEKIR C. Stability of black carrot anthocyanins in various fruit juices and nectars[J]. Food Chemistry, 2006, 97(4): 598-605.

[10] 唐啟義, 馮光明. 實用統(tǒng)計分析及其計算機處理平臺[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1997: 77-91.

[11] 徐位力, 羅煥亮, 范恩友, 等. 二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計對馬占相思組培增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化[J]. 廣西植物, 2002, 22(6): 517-520.

[12] CORRALES M, TOEPFL S, BUTSZ P, et al. Extraction of anthocyanins from grape by-products assisted by ultrasonics, high hydrostatic pressure or pulsed electric fields: a comparison[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2008, 9(1): 85-91.

[13] 馮建光, 谷文英. 葡萄皮紅色素的示差法測定[J]. 食品工業(yè)科技,2002, 22(9): 85-87.

[14] 楊兆艷. pH示差法測定桑椹紅色素中花青素含量的研究[J]. 食品科技, 2007, 32(4): 201-203.

[15] 劉仁道, 張猛, 李新賢. 草莓和藍(lán)莓果實花青素提取及定量方法的比較[J]. 園藝學(xué)報, 2008, 35(5): 655-660.

[16] 鄧紅, 仇農(nóng)學(xué), 孫俊, 等. 超聲波輔助提取文冠果籽油的工藝條件優(yōu)化[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報, 2007, 23(11): 249-254.

Optimization of Anthocyanidin Extraction from Black Mulberry (Morus nigra L.) by Quadratic Orthogonal Rotation Combination Design

YANG Song1,2，ZHOU Bei-bei2，CHENG Jiang-hua2，WU De-xuan1，Ding Zhi-en1,*，YAN Xiao-ming2,*
(1. College of Tea and Food, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China；
2. Institute of Agro-food Science and Technology, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei 230031, China)

A quadratic orthogonal rotation combination design was used to explore the effects of ethanol concentration,material-to-liquid ratio, extraction time and extraction temperature on extraction rate of anthocyanidin from black mulberry(Morus nigra L.) by ultrasonic-assisted extraction. A regression equation was established using DPS7.05 software. The optimal extraction conditions were found to be 52.46%－55.93% ethanol as extraction solvent at a liquid-to-material ratio of 39.51:1－42.43:1 (mL/g) for 27.77－32.23 min of extraction at 50.18－52.4 ℃. Under these conditions, the extraction rate of anthocyanidin was more than 67%.

black mulberry；anthocyanidin；orthogonal rotation combination design；extraction；optimization

TS202.3

A

1002-6630(2012)08-0033-06

2011-11-11

安徽省科技廳項目(100807030300)；安徽省財政廳項目

楊松(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：ys985826@163.com

*通信作者：丁之恩(1954—)，男，教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：dingze78@ahau.edu.cn

閆曉明(1963—)，男，研究員，本科，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：582511625@qq.com