二次正交旋轉組合設計優化藥桑花青素提取工藝

楊 松，周蓓蓓，程江華，鄔德軒，丁之恩,*，閆曉明,*

(1.安徽農業大學茶與食品學院，安徽 合肥 230036；2.安徽省農業科學院農產品加工研究所，安徽 合肥 230031)

二次正交旋轉組合設計優化藥桑花青素提取工藝

楊 松1,2，周蓓蓓2，程江華2，鄔德軒1，丁之恩1,*，閆曉明2,*

(1.安徽農業大學茶與食品學院，安徽 合肥 230036；2.安徽省農業科學院農產品加工研究所，安徽 合肥 230031)

在超聲波輔助條件下，采用四元二次正交旋轉組合設計研究乙醇體積分數、液料比、時間、溫度4個因素對藥桑花青素提取效率的影響，用DPS7.05軟件分析得出4個因素的回歸方程。結果表明，超聲波輔助提取最佳工藝條件為：乙醇體積分數范圍52.46%～55.93%、提取液料比范圍39.51:1～42.43:1(mL/g)、提取時間范圍27.77～32.23min、提取溫度范圍50.18～52.4℃，在此工藝條件下花青素提取效率均能達到67%以上。

藥桑；花青素；正交旋轉組合設計；提取；優化

新疆藥桑屬于半栽種的野生桑資源，藥桑在植物學分類上屬桑科，桑屬，黑桑種(Morus nigra Linn.)，新疆藥桑是我國唯一的黑桑種，也是一種在自然界極其罕見的具有22組染色體的22倍體桑樹種質資源[1-2]。藥桑作為珍稀的藥食兼用桑屬品種資源，近年來引起了國內外桑樹學科以及藥學、營養學專家的廣泛關注，開展了對藥桑生物活性成分及藥理作用的相關研究[3-5]。

合成色素穩定性高，著色力強且成本低廉，但隨著研究的深入，發現很多曾允許使用的人工合成食用色素對人體造成程度不一的損害。而天然色素具有安全、無毒、資源豐富的優點，并具有一定營養和藥理作用，故天然色素市場日益擴大[6]。花青素是天然色素中應用極其廣泛的一類色素，屬于多酚類化合物。花青素不但色澤鮮亮，還具有很強的抗氧化活性，能夠減少冠心病、癌癥和腦血管疾病的發病機率[7-9]。因此，優化花青素提取工藝，對花青素產品的開發具有重要的意義。

二次正交旋轉組合設計是正交回歸試驗設計的一種，它既能分析各處理因子的影響，又能建立定量的數學模型，屬更高級的試驗設計技術[10-11]。

本研究在對6個提取條件進行單因素考察基礎上，采用二次正交旋轉設計法優化花青素提取工藝參數，提高花青素提取率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑椹：新疆藥桑品種，新疆維吾爾自治區和田蠶桑科學研究所提供。

無水乙醇、濃鹽酸、氯化鉀、醋酸鈉均為分析純。

1.2 儀器與設備

SP-75紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；FS-450超聲波處理器 上海生析超聲儀器有限公司；真空干燥箱 上海實驗儀器總廠；DFT-100多功能中藥粉碎機 溫嶺市大德中藥機械有限公司；FA2104電子天平 海民橋精密科學儀器有限公司；FD-1CE真空冷凍干燥機 北京德天佑科技發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑椹花青素提取流程

1.3.2 桑椹花青素含量測定及提取率計算[12-15]

桑椹干粉中花青素含量的測定：精確稱取2.000g桑椹干粉，置于錐形瓶中，加入80mL酸性乙醇在超聲波輔助條件下提取，重復提取數次，直至提取液無色，提取液按pH示差法測定桑椹干粉花青素含量。

pH示差法操作如下：準確移取2份1mL待測提取液分別置于10mL離心管中，再分別加入8mL pH1.0和pH4.5的緩沖液于離心管中。達平衡后，分別在520nm和700nm波長處測定吸光度。花青素含量計算公式如下：

式中：ΔA為吸光度差，ΔA＝(A520nm,pH1.0－A700nm,pH1.0)－(A520nm,pH4.5－A700nm,pH4.5)；ε為矢車菊花素-3-葡萄糖苷的消光系數，26900(L/(mol·cm))；DF為稀釋倍數；MW為矢車菊花素-3-葡萄糖苷的摩爾質量，449.2g/moL；L為光程，1c m。

1.3.3 單因素試驗

精確稱取1.000g桑椹干粉，加入一定體積的提取試劑。按不同的試驗設計條件提取花青素，對提取溶液、提取液體積分數、提取溫度、提取時間、提取液料比和超聲波功率進行單因素試驗，重復3次，取平均值。

1.3.4 二次正交旋轉試驗設計

在單因素試驗基礎上，選擇合適的單因素，設計4因素4水平的二次正交旋轉試驗，以提取率為考察指標，確定最優提取工藝參數。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取試劑對花青素提取率的影響

圖1 提取試劑對提取率的影響Fig.1 Effect of extraction solvent type on extraction efficiency

在提取溫度50℃、提取時間30min、液料比30:1(mL/g)、超聲波功率300W條件下，不同提取試劑對提取率的影響。如圖1所示，酸性乙醇的提取效果最好。花青素屬于黃酮類物質，根據“相似相溶”原理，可溶于水、甲醇、乙醇等極性溶劑，并且在與其極性最相近的溶液中溶解性最好。此外，花青素在弱酸性條件下性質穩定，結構不易發生改變，而在中性和弱堿性條件下性質相對不穩定。因此，本實驗以酸性乙醇作為提取溶劑。

2.1.2 乙醇體積分數對花青素提取率的影響

圖2 乙醇體積分數對花青素提取率的影響Fig.2 Effect of alcohol concentration on extraction efficiency

在酸性乙醇為提取試劑(其他條件如2.1.1節)下，不同體積分數乙醇對提取率的影響如由圖2所示，提取率隨著酸性乙醇體積分數的增大先不斷增高至最高點后降低。當酸性乙醇體積分數為50%時，提取率最大。乙醇浸提使花青素溶入乙醇溶液，乙醇溶液的極性隨著乙醇體積分數的升高而變小，當溶劑極性和花青素極性最相近時，花青素在溶劑中溶解性最好，則花青素提取率最高。

2.1.3 提取溫度對花青素提取率的影響

圖3 提取溫度對花青素提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

圖3表示不同溫度對花青素提取率的影響(50%酸性乙醇為提取試劑，其他條件如2.1.1節)。由圖3可知，溫度較低時，桑椹花青素提取率隨著提取溫度的升高而增長。當提取溫度為50℃時，提取率最大。但是繼續升高溫度后提取率反而下降，這可能與花色苷物質耐熱性較差，在高溫下易發生結構發生變化而褪色有關。因此過高的溫度(＞50℃)會對桑椹花青素的色價及穩定性有造成一定影響。而低溫條件(＜50℃)下提取率較低，造成資源的浪費。

2.1.4 超聲波功率對花青素提取率的影響

圖4 超聲波功率對提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction efficiency

圖4表示不同超聲波功率對花青素提取率的影響(50%酸性乙醇為提取試劑，其他條件如2.1.1節)。由圖4可知，超聲波功率在100～500W時，花青素提取率隨著超聲波功率的提高而提高。當超聲波功率達到300W時，繼續提高超聲波功率，提取率無顯著增長。超聲波的提取機理主要是超聲波在提取溶液中產生的“空化效應”和機械作用：超聲波一方面可有效地破碎桑椹的細胞壁，使花青素呈游離狀態并溶入乙醇中，另一方面可加速乙醇的分子運動，使乙醇和花青素中快速接觸，相互溶合、混合。當超聲波功率較低時，破碎力度不夠，使得花青素不能快速的融入乙醇中，所以提取率較低。但超聲波功率過高時，環境噪音過大，且提取率沒有顯著提高，因此，考慮節能環保等因素，故選用300W作為提取功率。

2.1.5 提取時間對花青素提取率的影響

圖5 提取時間對提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction efficiency

圖5表示不同的提取時間對花青素提取率的影響(50%酸性乙醇為提取試劑，其他條件如2.1.1節)。從圖5可見，提取時間在10～50min時，花青素提取率隨著提取時間的延長先提高后降低。當提取時間為20min時，提取率最大。提取時間為10min時，由于提取時間較短導致桑椹細胞中花青素無法得到完全的釋放，使得提取效果不理想。但是當提取時間超過30min時，由于提取時間過長，導致花青素的結構可能受到超聲作用的破壞而使提取率下降。

2.1.6 液料比對花青素提取率的影響

圖6 液料比對花青素提取率的影響Fig.6 Effect of solid-to-liquid ratio on extraction efficiency

圖6表示在不同的液料比對花青素提取率的影響(50%酸性乙醇為提取試劑，其他條件如2.1.1節)。由圖6可見，液料比在10:1～30:1(mL/g)時，花青素提取率隨著液料比的增加而提高，這與提取液料比過低，桑椹中花青素無法被乙醇溶液完全浸提出來有關。在液料比達到30:1(mL/g)后，花青素提取效率無顯著升高。因此選定30:1(mL/g)為最佳液料比。

2.2 二次正交旋轉試驗

2.2.1 二次正交旋轉試驗設計與結果

表1 二次正交旋轉試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal rotation combination design

表2 藥桑花青素提取二次正交旋轉組合設計試驗方案及結果Table 2 Orthogonal rotation combination design scheme and results

根據單因素試驗結果，以花青素提取液中花青素含量為考察目標，設計4因素4水平的二次正交旋轉試驗。確定提乙醇體積分數(X1)、提取液料比(X2)、提取時間(X3)、提取溫度(X4)的零水平分別為50%、30:1(mL/g)、30min、50℃，試驗設計及結果見表1、2。

2.2.2 回歸模型建立與檢驗

采用DPS數據處理系統對表2中的結果進行二次多項式逐步回歸分析，得到花青素提取效率(Y)和乙醇體積分數、提取液料比、提取時間和提取溫度的回歸模型：

表3 試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of the experimental results of orthogonal rotation combination design

由表3可見，回歸方程的矢擬性檢驗F1＝0.79616＜F0.05(10,11)＝ 2.85 及 F0.01(10,11)＝ 4.54，F2＝ 6.17132 ＞F0.01(14,21)＝3.07及F0.05(14,21)＝2.20，說明模型的預測準確，模型成立，可用于描述花青素提取效率隨提取液料比、提取時間、提取溫度、乙醇體積分數變化的規律。

在α＝0.05顯著水平上剔除不顯著項后，簡化的回歸方程：

2.2.3 主效應分析

P值即概率，反映某一事件發生的可能性大小。各因素的P值可以反映出各因素對試驗指標的重要性，P值越小，表明該因素對試驗結果影響越大，即重要性越大[16]。由表3可見，4個試驗因素對花青素提取率影響大小依次為提取液料比＞提取溫度＞乙醇體積分數＞提取時間。

2.2.4 單因素效應分析

將得到的回歸方程中的四個因素任意三個固定在零水平，得：

把4個因子的取值固定在－2、－1.6、－1.2、－0.8、－0.4、0、0.4、0.8、1.2、1.6、2水平，根據上述方程，計算出各因子在11個不同水平上花青素提取效率(Y)，并以此作圖，結果見圖7。

圖7 各單因素與花青素提取效率的關系Fig.7 Relationship between each variable and extraction efficiency of anthocyanidin

由圖7可見，在各因子處于－2～2這一水平區間時，提取液料比與花青素提取率的關系最接近線性條件，表明提取液料比對花青素提取效率的影響最顯著，另外提取液料比的升高有利于花青素提取率的增大。而乙醇體積分數、提取時間和提取溫度與花青素提取率的關系曲線呈拋物線狀，表明這3個因素不能無限制的升高，超過一定范圍便會使花青素提取率降低。尤其是提取溫度的升高會顯著降低花青素提取率。此外，圖7中各因素變化趨勢與前面單因素試驗結果基本吻合。

2.2.5 提取參數優化

為了得出最佳的提取參數，通常對試驗數據進行頻數分析。選取了提取效率大于67%的155個方案進行頻數分析，得到95%的置信區間，如表4所示。

由表4可知，花青素提取最佳工藝參數范圍為：乙醇體積分數52.46%～55.93%、提取液料比39.51:1～42.43:1(mL/g)、提取時間27.77～32.23min、提取溫度50.18～52.4℃，在此參數范圍內，花青素提取效率均大于67%。

表4 各變量取值頻率分布Table 4 Probability distribution of each variable

2.2.6 驗證實驗

從優化提取參數范圍內隨機選擇3個組合進行驗證實驗，結果見表5。

表5 驗證實驗結果Table 5 Results of validation experiments

由表5可見，3次驗證實驗平均理論值為71.66%，平均實際值為71.18%，兩者僅相差0.48%，可見實際值與理論值基本吻合，且均在67%以上。由此可知，采用本實驗的工藝參數，可獲得67%以上的花青素提取效率。

3 結 論

根據二次正交旋轉試驗結果發現，花青素提取效率影響大小的因素依次為提取料液比＞提取溫度＞乙醇體積分數＞提取時間，且花青素提取最佳工藝參數范圍為乙醇體積分數52.46%～55.93%、提取料液比39.51:1～42.43:1(mL/g)、提取時間27.77～32.23min、提取溫度50.18～52.4℃，在此參數范圍內，花青素提取效率均大于67%。最后進行驗證實驗，結果與預測值基本吻合。因此本研究為提取桑椹花青素提供了較好的提取方案。

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Optimization of Anthocyanidin Extraction from Black Mulberry (Morus nigra L.) by Quadratic Orthogonal Rotation Combination Design

YANG Song1,2，ZHOU Bei-bei2，CHENG Jiang-hua2，WU De-xuan1，Ding Zhi-en1,*，YAN Xiao-ming2,*
(1. College of Tea and Food, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China；
2. Institute of Agro-food Science and Technology, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei 230031, China)

A quadratic orthogonal rotation combination design was used to explore the effects of ethanol concentration,material-to-liquid ratio, extraction time and extraction temperature on extraction rate of anthocyanidin from black mulberry(Morus nigra L.) by ultrasonic-assisted extraction. A regression equation was established using DPS7.05 software. The optimal extraction conditions were found to be 52.46%－55.93% ethanol as extraction solvent at a liquid-to-material ratio of 39.51:1－42.43:1 (mL/g) for 27.77－32.23 min of extraction at 50.18－52.4 ℃. Under these conditions, the extraction rate of anthocyanidin was more than 67%.

black mulberry；anthocyanidin；orthogonal rotation combination design；extraction；optimization

TS202.3

A

1002-6630(2012)08-0033-06

2011-11-11

安徽省科技廳項目(100807030300)；安徽省財政廳項目

楊松(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為農產品加工與貯藏。E-mail：ys985826@163.com

*通信作者：丁之恩(1954—)，男，教授，博士，研究方向為農產品加工與貯藏。E-mail：dingze78@ahau.edu.cn

閆曉明(1963—)，男，研究員，本科，研究方向為農產品加工與貯藏。E-mail：582511625@qq.com