商業果膠酶對酸櫻桃果漿酶解效果的優化

高 佳，王寶剛，馮曉元,*，李文生，張開春

(1.四川農業大學園藝學院，四川 雅安 625014；2.四川省農業科學院農產品加工研究所，四川 成都 610066；3.北京市農林科學院林業果樹研究所，北京 100093)

商業果膠酶對酸櫻桃果漿酶解效果的優化

高 佳1,2，王寶剛3，馮曉元3,*，李文生3，張開春3

(1.四川農業大學園藝學院，四川 雅安 625014；2.四川省農業科學院農產品加工研究所，四川 成都 610066；3.北京市農林科學院林業果樹研究所，北京 100093)

以酸櫻桃(Prunus cerasus)成熟果實為試材，結合出汁率、透光率、濁度、可溶性固形物、pH值、果膠含量和花色苷含量等指標，從7種商品果膠酶制劑中篩選出對酸櫻桃果漿酶解效果較好的Ultra AFP果膠酶。通過單因素試驗和Box-Behnken響應面分析確定酸櫻桃果漿酶解最優工藝條件。結果表明：加酶量、酶解溫度和酶解時間對出汁率、透光率和濁度具有顯著影響；加酶量1.73mL/kg、酶解溫度46℃、酶解時間2.3h最優條件下，酸櫻桃果漿出汁率為86.2%、透光率為90.5%、濁度為2.67NTU。

酸櫻桃果漿；果膠酶；響應面法；優化

酸櫻桃(Prunus cerasus Ledeb)又名歐洲酸櫻桃(sour cherry、tart cherry)，原產于歐洲，果實色澤鮮艷，具有獨特酸香味且營養豐富均衡，尤其富含花色苷、褪黑激素、芥子醇、鞣花酸等化合物，具有調節睡眠、清除自由基、抗氧化、抗癌等多種功效，主要用于果汁、果酒、果醬等加工制品[1-2]。酸櫻桃果實細胞壁中含有大量果膠、纖維素等大分子物質，破碎后果漿黏稠，壓榨取汁困難且出汁率低[3]。商品果膠酶制劑是一類含有果膠酶、纖維素酶和蛋白酶等具有催化活性的復合酶，能降解果膠、纖維素和蛋白質等，降低果漿黏度，改善壓榨性能，提高果汁出汁率和澄清度，減少果渣產生，保留果實獨特風味和營養成分，有利于后續的澄清、過濾和濃縮工序[4]。

響應面分析法(response surface methodology，RSM)是一種優化反應條件、解決多變量問題的有效統計方法[5]。與傳統正交試驗相比，RSM試驗周期短、求得回歸方程精度高、更有效直觀[6]。本實驗比較7種商品果膠酶對酸櫻桃果漿酶解效果的差異，應用Box-Behnken響應面法建立酶解條件和酸櫻桃果漿各項指標之間的數學模型，以探討不同酶解條件下各響應值的變化規律，并得到最佳酶解工藝，為酸櫻桃酶解制汁提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成熟酸櫻桃(Prunus cerasus Ledeb. cv. CAB)鮮果，于2010年6月中旬采于北京市農林科學院林業果樹研究所櫻桃種質資源圃。剔除殘、病、次果，清洗、消毒、瀝干、摘除果柄后于－30℃冷凍貯藏，備用。

商品32果膠酶：Pectinex Ultra AFP、Pectinex Ultra Color、Pectinex Ultra Clear、Pectinex Yield Mash 諾維信(中國)投資有限公司；Ra pida se C 80MA X、Klerzyme 150 帝斯曼(中國)有限公司；JN-700 山東棗莊市杰諾生物酶有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；3K15型高速冷凍離心機 美國Sigma公司；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；TN100型濁度儀 美國Euteoh公司；BSA224SCW型電子天平 北京賽多利思科學儀器有限公司；PAL-1折光儀 日本Atago公司；PHS-3C型精密pH計上海雷磁儀器廠；SG260E1多功能榨汁機 浙江蘇泊爾炊具股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 商品果膠酶的篩選

酸櫻桃冷凍鮮果常溫解凍后去除果核，迅速打漿。將7種商品果膠酶制劑(Ultra AFP、Ultra Color、Ultra Clear、Yield Mash、Rapidase C80MAX、Klerzyme 150、JN-700)用去離子水稀釋10倍后分別加入等量酸櫻桃果漿中混勻，50℃保溫水浴1h，果膠酶的添加量統一為1.4mL/kg。酶解后迅速加熱到90℃滅酶2min，于8000r/min離心10min，上清液用快速濾紙抽濾，除去少量雜質后即為酸櫻桃粗汁。測定各種果膠酶酶解后酸櫻桃粗汁的理化指標。

1.3.2 酶解單因素試驗

將1.3.1節中篩選出的果膠酶進行酶解單因素試驗。由于酸櫻桃果漿pH值較低，已在試驗所用果膠酶的適用范圍內，因此試驗中不再調節pH值。采用篩選好的果膠酶分別進行果膠酶添加量0.6～2.0mL/kg、酶解溫度30～70℃、酶解時間0.5～5h的單因素試驗。當選定某一因素進行單因素試驗時，其余酶解條件控制在加酶量1.4mL/kg、酶解溫度50℃、酶解時間1h。

1.3.3 酶解條件響應面優化分析

在單因素試驗基礎上，以果膠酶用量、酶解溫度和酶解時間為影響因素，出汁率、透光率和濁度為響應值，運用Box-Behnken響應面分析方法進行試驗。實驗數據采用Design-expert 7.0統計軟件進行回歸分析，確定酸櫻桃酶解最佳工藝條件，并進行驗證實驗。

1.3.4 酸櫻桃清汁相關指標的計算或測定

出汁率：酶解后酸櫻桃清汁質量占酶解前果漿質量的百分數。

透光率(T)[7]：采用紫外-可見分光光度計測定波長660nm處酶解后酸櫻桃粗汁的透光率，以超純水作對照(計為 100%)。

濁度：采用濁度儀測定(單位NTU)；pH值：采用精密pH計測定；可溶性固形物(soluable solid，SS)含量：采用折光儀測定，以超純水作對照；果膠定性[4]：取1mL酶解后的酸櫻桃粗汁于試管中，加入5mL酸化乙醇(濃鹽酸體積分數1%)，輕輕倒轉幾次試管混合均勻，靜置3 0min，觀察果汁狀態，若有絮狀沉淀，表明果膠未分解完全，以“＋”的多少描述沉淀量多少。

花色苷含量：采用pH示差法[8]測定。于兩只25mL具塞試管中分別加入2mL酸櫻桃粗汁，一只試管加入8mL pH1.0緩沖溶液[0.2mol/L KCl溶液-0.2mol/L HCl溶液(1:3，V/V)]，適當調節pH(1.0±0.1)，另一只試管加入8mL pH4.5緩沖溶液[1mol/L NaAc溶液-1mol/L HCl溶液-H2O(10:6:9，V/V)]，適當調節pH(4.5±0.1)，混勻后靜置30min，測定510nm和700nm波長處的吸光度A510nm和A700nm。分別以對應pH1.0緩沖溶液和pH4.5緩沖溶液作對照，實驗重復3次，計算平均值。

式中：A為吸光度；ε為矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數，26900L/(mol·cm)；MW為花色苷的摩爾質量，449.2g/mol；DF為稀釋倍數；L為比色皿的寬度，1 c m。

1.3.5 數據分析

結果采用SPSS 16.0統計軟件進行差異顯著性檢驗(α＝ 0.05)。

2 結果與分析

2.1 7種商品果膠酶酶解效果比較

商業用果膠酶制劑通常是由聚半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶、果膠酯酶等構成的多種酶的混合物，有的還含有蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等[4]，因此不同公司生產的酶活性和各組分功能、作用機理各不相同。本實驗采用7種不同來源商品果膠酶進行對比實驗，得出不同果膠酶對酸櫻桃果漿酶解效果的比較。從表1可見，酶解后的酸櫻桃清汁出汁率、透光率、花色苷顯著增高，濁度降低，可溶性固形物略有增加， pH值變化不明顯。其中出汁率均提高7%以上，透光率提高5%以上，濁度降低10NTU以上，可見果膠酶對酸櫻桃果漿降低黏度、改善壓榨性能，提高出汁率、澄清度和降低濁度都有明顯促進作用。果膠酶對細胞壁的分解也有利于色素和可溶性固形物的溶出[9]。

表1 不同商業果膠酶酶解效果Table 1 Effect of different commercial pectinases on juice yield, transmittance and turbidity

各種商品果膠酶制劑中所含的實質性酶種類和活性不同，對不同果品的酶解效力也不同。比較7種果膠酶，其中Ultra AFP和Klerzyme 150作用后的果漿出汁率、透光率和濁度顯著優于其他種類的果膠酶，果膠定性檢測表明酶解后果膠含量相對較低；Yield Mash和JN-700作用后的果漿雖然具有較高的出汁率，但透光率較低、濁度較高。比較Ultra AFP和Klerzyme 150，雖然Klerzyme 150透光率較高，但Ultra AFP在提高水果出汁率、花色苷含量和果膠分解上更好。因此，采用Ultra AFP果膠酶進行后續研究。

2.2 酶解單因素試驗

2.2.1 果膠酶添加量對酸櫻桃果漿酶解效果的影響

圖1 果膠酶添加量對酶解效果的影響Fig.1 Effect of pectinase concentration on juice yield, transmittance and turbidity

由圖1可見，果膠酶添加量對酸櫻桃果漿出汁率和濁度的影響較大，對透光率的影響變化趨勢相對較緩。隨著加酶量的增加，出汁率和透光率均逐漸升高；加酶量大于1.2mL/kg后，變化較平緩。濁度變化趨勢相反，隨著加酶量的增加呈現先降低后增加的趨勢，在1.2～1.8mL/kg保持較低水平。濁度是液體中不溶性顆粒多少的指標，表示液體的渾濁程度[10]。出現上述變化規律是由于果膠酶添加量增加使果膠、纖維素等大分子物質的分解更加充分，細胞壁分解，水分被釋出，出汁率和透光率增大[11-12]。當加酶量超過1.8mL/kg后，由于果膠酶本身也屬于蛋白質，過量加入引起果汁的渾濁。為進一步驗證，實驗采用加酶量1.0～2.0mL/kg進行后續響應面優化。

2.2.2 酶解溫度對酸櫻桃果漿酶解效果的影響

由圖2可知，隨著酶解溫度的升高，出汁率和透光率在40～50℃之間得到最大值，之后逐漸降低。濁度在40～55℃之間較低，超過60℃之后迅速升高。這是因為隨著溫度的升高，酶活性增加，當溫度超過60℃時，酶蛋白變性，導致酶解速度降低。同時，較高溫度對色素、VC等熱敏性營養物質的破壞較大[13]。綜合考慮，選取酶解溫度在35～55℃之間進行響應面優化。

圖2 酶解溫度對酶解效果的影響Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on juice yield, transmittance and turbidity

2.2.3 酶解時間對酸櫻桃果漿酶解效果的影響

由圖3可知，隨著酶解時間的延長，酸櫻桃果漿出汁率和透光率逐漸升高，當酶解時間大于3.5h后，出汁率和透光率降低；濁度變化趨勢相反，在1～2.5h之間較低。分析原因，隨著酶解時間的延長，酶活性受損，果漿溶出物質增加，導致濁度升高，使榨汁困難，出汁率和透光率降低。同時，長時間溫度處理對香味等營養成分損失較大，可能引起微生物污染[5]。因此，酶解時間確定為1～2.5h為宜。

圖3 酶解時間對酶解效果的影響Fig.3 Effect of hydrolysis duration on juice yield, transmittance and turbidity

2.3 酶解工藝條件的響應面優化分析

2.3.1 響應面法試驗設計及結果

綜合單因素試驗結果，以果膠酶添加量、酶解溫度、酶解時間為自變量，分別以X1、X2、X3表示，以出汁率、透光率和濁度為響應值進行Box-Behnken試驗設計，方案及結果見表2，17個試驗點隨機進行，重復3次，結果取平均值。

表2 酶解工藝條件優化響應面試驗設計及結果Table 2 Box-Behnken design and experimental results

2.3.2 酶解條件對酸櫻桃果漿出汁率的影響

通過對試驗結果進行回歸分析，建立響應面回歸模型，得到出汁率的回歸方程：

表3 出汁率回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis for juice yield with various hydrolysis conditions

由表3方差分析結果可知，出汁率回歸方程(模型)的回歸效果極顯著。對響應值出汁率作用顯著的是X1、X2、X3、X2X3、X12、X22、X32；各因素對出汁率影響的大小順序為果膠酶添加量＞酶解溫度＞酶解時間。

RSM的圖形是特定的響應值(Y)對應自變量構成的一個三維空間圖，可以直觀地反映出自變量對響應變量的影響[9]。如圖4所示，酸櫻桃果漿出汁率在加酶量1.75mL/kg、酶解溫度45℃、酶解時間2h時較高，圖形表現為凸起。

圖4 各因素交互作用對出汁率影響的響應面圖Fig.4 Response surface plot showing the interactive effects of pectinase concentration, hydrolysis temperature and hydrolysis duration on juice yield

2.3.3 酶解條件對酸櫻桃果漿透光率的影響

通過對試驗結果進行回歸分析，建立響應面回歸模型，得到透光率的回歸方程：

表4 透光率回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis for transmittance with various hydrolysis conditions

由表4方差分析結果可知，透光率回歸方程(模型)的回歸效果極顯著。對響應值透光率作用顯著的是X1、X3、X12、X22、X32；各因素對透光率影響的大小順序為果膠酶添加量＞酶解時間＞酶解溫度。

圖5 各因素交互作用對透光率影響的響應面圖Fig.5 Response surface plot showing the interactive effects of pectinase concentration, hydrolysis temperature and hydrolysis duration on transmittance

如圖5所示，酸櫻桃果漿透光率在加酶量1.5mL/kg、酶解溫度45℃、酶解時間2h時較高，圖形中表現為凸起。

2.3.4 酶解條件對酸櫻桃果漿濁度的影響

通過對試驗結果進行回歸分析，建立響應面回歸模型，得到濁度的回歸方程：

表5 濁度回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis for turbidity with various hydrolysis conditions

由表5方差分析結果可知，濁度回歸方程(模型)的回歸效果極顯著。對響應值濁度作用顯著的是X1、X2、X3、X2X3、X12、X22、X32；各因素對濁度影響的大小順序為果膠酶添加量＞酶解溫度＞酶解時間。

圖6 各因素交互作用對濁度影響的響應面圖Fig.6 Response surface plot showing the interactive effects of pectinase concentration, hydrolysis temperature and hydrolysis duration on turbidity

如圖6所示，酸櫻桃果漿濁度在加酶量1.5mL/kg、酶解溫度45℃、酶解時間2h時較低，圖形中表現為凹陷。

2.4 酶解工藝條件驗證

根據響應面優化分析得出理論最優酶解工藝條件為加酶量1.73mL/kg、酶解溫度45.73℃、酶解時間2.26h。此條件下酶解預測值為出汁率86.9%、透光率89.9%、濁度2.54NTU。根據理論推薦酶解工藝和實際操作的方便性進行驗證實驗，重復3次，結果取平均值。最終得出，在加酶量1.73mL/kg、酶解溫度46℃、酶解時間2.3h條件下，酸櫻桃果漿酶解出汁率達86.2%、透光率90.5%、濁度2.67NTU。可知酸櫻桃果漿出汁率、透光率和濁度實際測定值與理論預測值接近，誤差較小，說明該方程與實際情況擬合很好。

3 結 論

3.1 實驗結合出汁率、透光率、濁度、可溶性固形物、pH值、果膠含量和花色苷含量等指標，從7種商品果膠酶制劑中篩選出對酸櫻桃果漿酶解效果較好的Ultra AFP果膠酶。

3.2 選用Ultra AFP果膠酶在單因素試驗的基礎上，通過響應面分析確定了酸櫻桃果漿酶解工藝條件為：加酶量1.73mL/kg，酶解溫度46℃，酶解時間2.3h。此條件下酸櫻桃果漿酶解后出汁率86.2%、透光率90.5%、濁度2.67NTU。各因素對出汁率和濁度影響的大小順序為果膠酶添加量＞酶解溫度＞酶解時間，對透光率影響的大小順序為果膠酶添加量＞酶解時間＞酶解溫度。

3.3 經回歸分析和驗證性實驗表明，響應面法能較好的對酸櫻桃果漿酶解工藝進行分析和參數優化，所得酶解工藝條件可行。

[1] KIRAKOSYAN A, SEYMOUR E M, URCUYOLLANES D E, et al.Chemical profile and antioxidant capacities of tart cherry products[J].Food Chemistry, 2009, 115(1): 20-25.

[2] 崔新穎, 李香艷, 孔祥雨, 等. 酸櫻桃果實有效成分及藥理作用的研究[J]. 北華大學學報: 自然科學版, 2007, 8(2): 145-149.

[3] MANUEL P, BIRGITTE Z P, BIRGITTE Z, et al. Juice clarification by protease and pectinase treatments indicates new roles of pectin and protein in cherry juice turbidity[J]. Food and Bioproducts Processing,2010, 88(2/3): 259-265.

[4] 王衛東, 孫月娥. 果膠酶及其在果蔬汁加工中的應用[J]. 食品研究與開發, 2006, 27(11): 222-226.

[5] 張瑤, 蒲彪, 劉云, 等. 枇杷果漿酶解工藝的響應面法優化[J]. 食品科學, 2010, 31(14): 106-110.

[6] LEE W C, YUSOF S, HAMID N S A. Optimizing conditions for enzymatic clarification of banana juice using response surface methodology(RSM)[J]. Journal of Food Engineering, 2006, 73(1): 55-63.

[7] 王衛東, 許時嬰. 黑莓澄清汁的酶解工藝[J]. 食品與發酵工業, 2006,32(10): 156-159.

[8] LEE J, DURST R W, WROLSTAD R E. Determination of total monomeric anthocyanin pigment content of fruit juices, beverages, natural colorants and wines by the pH differential method: collaborative study[J]. Journal of AOAC International, 2005, 88(5): 1269-1278.

[9] LIEW A A G, SULAIMAN N M, AROUA M K, et al. Response surface optimization of conditions for clarification of carambola fruit juice using a commercial enzyme[J]. Journal of Food Engineering, 2007, 81(1): 65-71.

[10] 陳啟聰, 黃惠華. 復合酶對香蕉果漿的酶解效果優化研究[J]. 食品與發酵工業, 2009, 35(10): 186-190.

[11] 閆瑩, 梁艷暉. 果膠酶對香蕉汁澄清的工藝研究[J]. 農產品加工: 學刊, 2007(1): 59-63.

[12] 但曉容, 張穎, 盧曉黎. 響應面法優化酶解制備板栗清汁工藝條件研究[J]. 食品科學, 2008, 29(12): 185-189.

[13] 魯周民, 張麗, 盧蓉, 等. 酶解條件對紅棗汁主要成分的影響[J]. 農業工程學報, 2009, 25(1): 300-302.

Optimization of Enzymolysis of Sour Cherry by Commercial Pectinase

GAO Jia1,2，WANG Bao-gang3，FENG Xiao-yuan3,*，LI Wen-sheng3，ZHANG Kai-chun3
(1. College of Horticulture, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China；
2. Institute of Agro-products Prossessing, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China；
3. Institute of Forestry and Pomology, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100093, China)

Physico-chemical characteristics of juice yield, transmittance, turbidity, soluble solid content, pH, pectin content and anthocyanin content of sour cherry pulp were evaluated after treatment with various commercial pectinases. Ultra AFP was the best enzymes among 7 commercial pectinases. One-factor-at-a-time testing and response surface analysis based on Box-Behnken design were used to determine the optimal conditions for hydrolyzing sour cherry pulp with Ultra AFP. It was indicated that all hydrolysis conditions under investigation significantly influenced juice yield, transmittance and turbidity.Under the optimal hydrolysis conditions: 2.3 h of hydrolysis at 46 ℃ and an enzyme dose of 1.73 mL/kg, the juice yield,transmittance and turbidity of the samples were 86.2%, 90.5% and 2.67 NTU, respectively.

sour cherry pulp；pectinase；response surface methodology (RSM)；optimization

TS255.44

A

1002-6630(2012)08-0060-06

2011-04-07

國家公益性行業(農業)科研專項(200903019)；北京市農林科學院科技創新能力建設專項(KJCX201102004)

高佳(1983—)，女，博士，研究方向為果蔬貯藏加工。E-mail：tcherry2011@gmail.com

*通信作者：馮曉元(1965—)，女，研究員，博士，研究方向為食品科學。E-mail：xyfeng@yahoo.cn