響應(yīng)面法優(yōu)化豐年蟲卵殼脫乙酰度殼聚糖提取工藝

黃曉燕，張建新*，王 欣，彭鑫華，聶 路

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

響應(yīng)面法優(yōu)化豐年蟲卵殼脫乙酰度殼聚糖提取工藝

黃曉燕，張建新*，王 欣，彭鑫華，聶 路

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

以豐年蟲卵殼制備的甲殼素為原料，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)法，確定豐年蟲卵殼殼聚糖微波輔助提取技術(shù)的最佳工藝條件為微波時(shí)間33.4min、乙醇浸泡時(shí)間86min、堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)57.27%。按此工藝條件提取可獲得脫乙酰度為84.12%的豐年蟲殼聚糖。

殼聚糖；豐年蟲；響應(yīng)面；微波；脫乙酰度

豐年蟲(Chirocephalus diaphanous)，又名仙女蝦(fairy shrimp)，主要存在于海水及鹽湖水中[1]。對(duì)豐年蟲研究表明其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富[2-3]，且卵殼中含有豐富的甲殼素，但是對(duì)其卵殼的利用不是很充分。殼聚糖是甲殼素的脫乙酰化產(chǎn)物，比較甲殼素，溶解性更好，應(yīng)用范圍更廣。殼聚糖及其衍生物具有減肥、去脂、抗菌、增強(qiáng)免疫、降低血壓等作用[4-7]，因此殼聚糖在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。微波法具有降能耗，減污染，省時(shí)間和原料等優(yōu)勢(shì)[8-11]。本實(shí)驗(yàn)在堿液和有機(jī)溶劑結(jié)合條件下，同時(shí)進(jìn)行微波輔助分段處理，使得甲殼素充分脫乙?；苽漭^高脫乙酰度[12]殼聚糖，通過(guò)響應(yīng)曲面法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，探求微波提取脫乙酰度較高的殼聚糖的最佳工藝條件，為豐年蟲卵殼的利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豐年蟲卵殼 陜西豐源生物科技有限公司；豐年蟲甲殼素 實(shí)驗(yàn)室自制；N-乙酰-D-氨基葡萄糖(含量＞99%) 沃爾森生物技術(shù)有限公司；95%乙醇、NaOH、HCl、冰醋酸均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

P70D20T-J-D3型微波爐 格蘭仕微波爐電器有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；KDC-40型低速離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；FA2004型分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；101-Z型電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京科偉永興儀器有限公司；UV-2550型紫外分光光度計(jì)日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 豐年蟲卵殼殼聚糖生產(chǎn)工藝流程

豐年蟲甲殼素→乙醇浸泡→加入NaOH溶液后微波一段時(shí)間→離心→濾渣洗至中性→體積分?jǐn)?shù)10% HAc溶液攪拌1h →過(guò)濾→濾液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%氫氧化鈉溶液調(diào)至中性使殼聚糖析出→離心，沉淀洗至中性→干燥→殼聚糖純品

1.3.2 殼聚糖脫乙酰度的測(cè)定

采用紫外光譜法測(cè)定脫乙酰度，具體操作方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[13]。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取2g豐年蟲甲殼素放于150mL三角瓶中，按照1.3.1節(jié)工藝脫乙酰制備殼聚糖。選取乙醇浸泡時(shí)間、NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)、微波提取時(shí)間、微波功率為試驗(yàn)因素，以脫乙酰度為試驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)(基本條件為乙醇浸泡時(shí)間1h、NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%、微波提取時(shí)間20min、微波功率462W)。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以脫乙酰度為響應(yīng)值，對(duì)微波提取時(shí)間、乙醇浸泡時(shí)間、NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步優(yōu)化，因素水平見(jiàn)表1。

表1 中心組合試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of central composite design

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對(duì)殼聚糖脫乙酰度的影響

2.1.1 乙醇浸泡時(shí)間

圖1 乙醇浸泡時(shí)間對(duì)殼聚糖脫乙酰度的影響Fig.1 Effect of ethanol soaking time on deacetylation degree of chitosan

由圖1可知，隨著乙醇浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，甲殼素晶體束漸漸打開(kāi)有利于堿滲入到甲殼素的內(nèi)部，與乙酰基發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)物的脫乙酰度值隨之變大，在1.5h時(shí)達(dá)到最大，再延長(zhǎng)浸泡時(shí)間脫乙酰度值變化不大。試驗(yàn)選擇乙醇浸泡時(shí)間為1.5h。

2.1.2 NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)

圖2 NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)殼聚糖脫乙酰度的影響Fig.2 Effect of NaOH mass fraction on deacetylation degree of chitosan

由圖2可知，隨著堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，脫乙酰度值逐漸升高，55%后上升不明顯。這是由于在堿液介質(zhì)中，OH－進(jìn)攻酰氨基中的羰基，形成過(guò)渡態(tài)到C＝O雙鍵打開(kāi)，是一個(gè)可逆過(guò)程，而過(guò)渡態(tài)上乙?；碾x去是瞬間的[14]。堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)低時(shí)，脫乙?；磻?yīng)只在甲殼素表面進(jìn)行，隨著堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，擴(kuò)散到甲殼素內(nèi)部的OH－增多，但也造成脫落的乙?；龆喽绊憯U(kuò)散，這個(gè)復(fù)雜的過(guò)程有待于深入研究。試驗(yàn)選擇NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)55%。

2.1.3 微波提取時(shí)間

圖3 微波時(shí)間對(duì)殼聚糖脫乙酰度的影響Fig.3 Effect of microwave treatment time on deacetylation degree of chitosan

由圖3可知，隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)，脫乙酰度值增大，到25min時(shí)達(dá)到最大，之后變化緩和。微波對(duì)甲殼素脫乙酰反應(yīng)有一定的“非熱效應(yīng)”[15]，在加熱的同時(shí)，破壞了甲殼素分子鏈中的氫鍵，促進(jìn)分子鏈分散和NaOH溶液滲入。微波處理10min時(shí)，由于微波加熱升溫快，甲殼素表面出現(xiàn)結(jié)塊，所以試驗(yàn)中采取二次分段微波，即每10min時(shí)停止微波，將三角瓶振蕩至結(jié)塊被打散，制得脫乙酰度高的殼聚糖。試驗(yàn)選擇微波提取時(shí)間25min。

2.1.4 微波功率

由圖4可知，脫乙酰度值的變化隨著功率的增大而不斷增大，理論上微波功率越大越好，但是在試驗(yàn)中，功率太大，升溫太快而極易導(dǎo)致殼聚糖降解，故試驗(yàn)中選取462W為最佳微波功率。

圖4 微波功率對(duì)殼聚糖脫乙酰度的影響Fig.4 Effect of microwave power on deacetylation degree of chitosan

2.2 微波輔助提取較高脫乙酰度殼聚糖工藝的響應(yīng)面分析

2.2.1 模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

表2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Central composite design scheme and results for response surface analysis

中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2，應(yīng)用Design Expert 7.0.0軟件對(duì)各因素進(jìn)行多元回歸擬合分析，得回歸方程：

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variances for the experimental results of central composite design

中心組合試驗(yàn)方差分析結(jié)果見(jiàn)表3，對(duì)應(yīng)F表值[16]可知，整體模型P值為0.0004＜0.0001，該二次方程模型達(dá)到極顯著水平，可以應(yīng)用于工藝條件的優(yōu)化。失擬項(xiàng)P＝0.1627＞0.05，不顯著，說(shuō)明擬合程度良好，未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾很小，說(shuō)明該模型合適。各因素中NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響極顯著，乙醇浸泡時(shí)間影響顯著，微波時(shí)間影響不顯著，按照對(duì)脫乙酰度的影響排序：NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞乙醇浸泡時(shí)間＞微波時(shí)間。模型的決定系數(shù)R2為0.8821，說(shuō)明該模型滿足88.21%的樣品空間。因此可以用該模型方程來(lái)分析和預(yù)測(cè)不同提取條件下殼聚糖的脫乙酰度值的變化。

根據(jù)回歸方程，做出響應(yīng)曲面圖(圖5)。從圖5a可以看出，當(dāng)NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，在乙醇浸泡時(shí)間與微波時(shí)間的交互作用下存在一個(gè)脫乙酰度的最大值。當(dāng)乙醇浸泡時(shí)間小于1.5h時(shí)，隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)，殼聚糖脫乙酰度逐漸延長(zhǎng)；當(dāng)乙醇浸泡時(shí)間接近于最大值時(shí)，隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)，殼聚糖脫乙酰度平緩的變化且有所下降，因?yàn)榈椒磻?yīng)后期脫下來(lái)的乙?；鶗?huì)阻礙甲殼素顆粒外部脫乙酰的速率。當(dāng)微波時(shí)間一定時(shí)，脫乙酰度隨著乙醇浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)先升高后又降低，在大于1.92h時(shí)變化平緩，因?yàn)楹髞?lái)隨著乙醇的揮發(fā)會(huì)導(dǎo)致一部分甲殼素的氫鍵重新結(jié)合，使得堿液作用受阻，影響脫乙酰程度。

圖5 各兩因素交互作用對(duì)殼聚糖脫乙酰度影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots showing the effects of pairwise interactions among different factors on deacetylation degree of chitosan

從圖5b可以看出，當(dāng)乙醇浸泡時(shí)間一定時(shí)，NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)與微波時(shí)間的交互作用對(duì)脫乙酰度的影響。微波時(shí)間趨于最小值時(shí)，隨著NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，脫乙酰度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且大于55%之后變化趨勢(shì)平緩；微波時(shí)間趨于最大值時(shí)，隨著NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，脫乙酰度呈現(xiàn)先上升后平緩下降趨勢(shì)，在55%達(dá)到最大值。NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)在一定范圍內(nèi)，殼聚糖的脫乙酰度在隨微波時(shí)間的延長(zhǎng)而提高；當(dāng)NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于59.21%時(shí)，隨微波時(shí)間的延長(zhǎng)，殼聚糖的脫乙酰度逐漸趨于平緩，變化不明顯，影響不顯著。因?yàn)檫M(jìn)入甲殼素的OH－是有限的，隨著微波時(shí)間延長(zhǎng)，導(dǎo)致脫落下來(lái)的乙?；鶅?nèi)外積累，影響反應(yīng)的進(jìn)行。

從圖5c可以看出，當(dāng)NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，殼聚糖的脫乙酰度隨著乙醇浸泡時(shí)間的升高，當(dāng)浸泡時(shí)間大于1.5h時(shí)，增加趨于平緩。而當(dāng)乙醇浸泡時(shí)間趨于最小值時(shí)，脫乙酰度隨著NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大而逐漸增加，即NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大，較優(yōu)的乙醇浸泡時(shí)間是越短的；當(dāng)乙醇浸泡時(shí)間趨于最大值時(shí)，脫乙酰度隨著NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大而平緩降低。因?yàn)橐掖嫉膿]發(fā)導(dǎo)致部分打破的氫鍵重新結(jié)合，不利于堿液作用，導(dǎo)致脫乙酰程度下降。

2.2.2 最佳工藝條件的確定與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過(guò)Design Expert 7.0.0軟件在自變量范圍為[－1.682,1.682]內(nèi)，進(jìn)行二次回歸模型的預(yù)測(cè)，得到2個(gè)最佳條件的方案，結(jié)合實(shí)際情況，選取微波輔助提取高脫乙酰度的殼聚糖的最佳工藝條件為微波提取時(shí)間33.41min、乙醇浸泡時(shí)間1.44h、堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)57.27%，預(yù)測(cè)響應(yīng)值脫乙酰度為84.97%。考慮操作的方便性，將提取工藝參數(shù)修正為微波提取時(shí)間33.4min、乙醇浸泡時(shí)間86min、堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)57.27%，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，分段微波處理，實(shí)際測(cè)得的脫乙酰度值84.12%，與理論值的偏差約為1.0%，說(shuō)明響應(yīng)面法所得優(yōu)化提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié) 論

在提取殼聚糖的過(guò)程中，各因素脫乙酰度的影響排序?yàn)椋篘aOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞乙醇浸泡時(shí)間＞微波時(shí)間。通過(guò)單因素試驗(yàn)和應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化微波提取較高脫乙酰度殼聚糖的工藝，得出最佳工藝條件為微波時(shí)間33.4min、乙醇浸泡時(shí)間86min、堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)57.27%，在最適提取條件下脫乙酰度值可達(dá)到84.12%。并得到殼聚糖的脫乙酰度與各因素變量的二次方程模型，該模型回歸極顯著，對(duì)試驗(yàn)擬合較好，經(jīng)檢驗(yàn)證明該模型合理可靠，有一定實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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Optimization of Extraction Process for Highly Deacetylated Chitosan from Chirocephalus diaphanous Eggshell by Response Surface Methodology

HUANG Xiao-yan，ZHANG Jian-xin*，WANG Xin，PENG Xin-hua，NIE Lu
(College of Food Science and Engineering, Northwest A＆F University, Yangling 712100, China)

One-factor-at-a-time method and response surface methodology were used to optimize the microwave-assisted extraction of highly deacetylated chitosan from Chirocephalus diaphanous eggshell. The optimal extraction conditions for achieving maximum degree of deacetylation of chitosan were as follows: microwave treatment time 33.4 min, ethanol soaking time 86 min, NaOH concentration 57.27%. Under these conditions, chitosan with a degree of deacetylation of 84.12% was obtained from Chirocephalus diaphanous eggshell.

chitosan；Chirocephalus diaphanous；response surface methodology；microwave；degree of deacetylation

TS245.9

A

1002-6630(2012)08-0085-04

2011-03-24

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(2010A19)

黃曉燕(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與安全。E-mail：hxy4302040@163.com

*通信作者：張建新(1959—)，男，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)安全與標(biāo)準(zhǔn)化。E-mail：zhangjx59@foxmail.com