液相色譜串聯質譜法測定肉中丙硫咪唑及其代謝物

付曉芳，王 鵬，趙曉亞，李 晶，尚吟竹，葉 誠

(湖北出入境檢驗檢疫局技術中心，湖北 武漢 430050)

液相色譜串聯質譜法測定肉中丙硫咪唑及其代謝物

付曉芳，王 鵬，趙曉亞，李 晶，尚吟竹，葉 誠

(湖北出入境檢驗檢疫局技術中心，湖北 武漢 430050)

建立同時測定肉中丙硫咪唑及其代謝物丙硫咪唑砜、丙硫咪唑亞砜、2-氨基丙硫咪唑砜的液相色譜串聯質譜法。樣品用乙腈提取，液液分配凈化后，XDB-C18色譜柱分離，流動相乙腈:0.1%甲酸溶液(1:1，V/V)，外標法定量。丙硫咪唑及其3種代謝物的檢出限均為0.010mg/kg，在0.010～1.0mg/L范圍內其質量濃度與峰面積呈良好的線性關系，相關系數大于0.99。添加量為0.010～0.050mg/kg時的回收率為82.3%～97.6%，相對標準偏差為4.9%～12.9%。該方法簡便、快速、準確，可用于豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、香腸中丙硫咪唑及其代謝物的定性、定量檢測。

丙硫咪唑；液相色譜-串聯質譜；代謝物；肉

丙硫咪唑(albendazole，ABZ)，又名腸蟲清、阿苯達唑、抗蠕敏，是一種高效、廣譜、低毒的苯咪唑類抗蠕蟲藥，對肝蟲、吸蟲、絳蟲和胃腸道線蟲均有顯著作用。由于丙硫咪唑是治療線蟲和絳蟲的首選藥物，因此使用比較頻繁，很容易造成動物組織的殘留，危害人體健康。丙硫咪唑在體內會代謝為丙硫咪唑砜(albendazole sulfone，ABZ-SO)、丙硫咪唑亞砜(albendazole sulfoxide，ABZ-SO2)和2-氨基丙硫咪唑砜(albendazole-2-aminosulfone，ABZ-NH2)[1]。歐盟和我國均規定丙硫咪唑及其代謝物的總和在動物體內的最大殘留限量為100μg/kg，為了滿足歐盟和我國獸藥殘留監控的要求，有必要建立同時測定丙硫咪唑及3種代謝物的檢測方法。

目前，國內外對丙硫咪唑及其代謝物的研究主要集中在動物血漿中[2-5]，關于動物組織[6-9]、水產品[10-11]和飼料[12]中丙硫咪唑及其代謝物的報道較少，徐雪等[13-14]研究了組織中丙硫咪唑亞砜和砜的液相色譜串聯質譜法，沒有丙硫咪唑及其三種代謝物的方法報道。我國檢驗檢疫行業標準SN 0207—93《出口肉中丙硫咪唑殘留量檢驗方法》[15]，用配有熒光檢測器的液相色譜儀測定豬肉中的丙硫咪唑母體含量，而不是檢測丙硫咪唑及其3種代謝物的含量。本實驗用乙腈勻質提取肉及肉制品中丙硫咪唑及其代謝物，液液萃取去除提取液中的油脂，液相色譜串聯質譜法進行檢測，旨在為其標準的建立提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、香腸 武漢市場。

標準品丙硫咪唑、丙硫咪唑砜、丙硫咪唑亞砜和2-氨基丙硫咪唑砜(純度≥97%) Dr. Ehrenstorfer公司；乙腈(色譜純) 美國Fisher公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

1100 液相色譜儀 美國安捷倫公司；API 4000Q 三級四級桿質譜儀(配有電噴霧離子源) 美國AB公司；Harvard pump Ⅱ針泵 美國Varian公司；Allegra X-12R離心機 美國Beckman公司；渦旋混合器 德國IKA公司；高速均質器 美國Tomtec公司；旋轉蒸發儀 日本Eyela公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

標準儲備液：分別準確稱取丙硫咪唑及其3種代謝物標準品10.0mg，至于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配成1.0g/L的標準儲備液；混合標準溶液：分別移取標準儲備液，用乙腈稀釋成1×10-3g/L的混合標準溶液。

1.3.2 樣品制備

準確稱取肉樣5.0g于50mL離心管中，加入15mL乙腈，高速勻漿，3500r/min離心，上清液經無水硫酸鈉轉入梨形瓶中。10mL乙腈重復上述操作，乙腈層減壓濃縮至干。用2mL 90%乙腈溶解殘渣，加入5mL乙腈飽和的正己烷，渦旋，棄去正己烷層，下層過0.2μm濾膜，待進樣測定。

1.3.3 分析條件

色譜條件：色譜柱為Agilent Eclipes XDB-C18液相色譜柱(150mm×4.6mm i.d.，5μm)；預柱為Phenomenex C18(3.0mm i.d.×4.0mm)；流動相：乙腈:0.1%甲酸(1:1，V/V)。流速250μL/min，進樣量5μL，柱溫25℃。

質譜條件：電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)，正離子多反應監控(multi-reactions monitoring，M R M)掃描模式，離子源溫度4 8 0℃，離子源電壓5200V；霧化氣、氣簾氣和輔助氣為N2，其中霧化氣為0.08MPa，氣簾氣壓為0.05MPa，輔助氣流速為6L/min。MRM監測離子對、碰撞電壓及去簇電壓見表1。

表1 丙硫咪唑及其代謝物的質譜優化條件Table 1 Optimal MS/MS conditions of albendazole and its metabolites

2 結果與分析

2.1 質譜條件的選擇

將丙硫咪唑及其3種代謝物標準品溶液采用流動注射直接進樣，通過全掃描方式確定其母離子，再對母離子進行二級質譜掃描得到碎片離子，通過優化條件，得到二級質譜圖。通過多反應監測(MRM)選擇相對豐度較高的離子對為定性定量離子對，并對其去簇電壓、碰撞電壓等條件進行優化。

2.2 色譜條件的選擇

本實驗采用Agilent Eclips XDB-C18為色譜柱，用不同的流動相對丙硫咪唑及其代謝物進行分離，結果顯示：乙腈:0.1%甲酸溶液(1:1，V/V)為最佳分離體系，在保證有很好的分離效果前提下，運行一個樣品大約需要10min，優于文獻報道的其他分離體系效果。樣品分離譜圖如圖1所示。

圖1 丙硫咪唑及其3種代謝物的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram showing separaion of albendazole and its metabolites

2.3 樣品凈化方法的選擇

本實驗采用正己烷液液萃取的方法對提取液進行去脂凈化，去除提取液中脂肪等雜質。丙硫咪唑與2-氨基丙硫咪唑砜性質差別較大，丙硫咪唑是脂溶性物質，而2-氨基丙硫咪唑砜是水溶性物質，在凈化時溶劑的選擇會影響丙硫咪唑及其代謝物的回收率。為最大效率的去除雜質并保證丙硫咪唑及其代謝物的損失最小，對不同比例的乙腈-水進行考察，通過測定乙腈-水中丙硫咪唑及其代謝物的剩余量確定最佳的乙腈-水比例。具體方法：取0.1mL 100ng/mL的混合標準工作溶液，N2吹干，加1mL不同比例的乙腈-水溶液溶解殘渣，然后用1mL乙腈飽和的正己烷進行液液萃取，棄去正己烷層，然后用液相色譜串聯質譜分析乙腈-水溶液中丙硫咪唑及其代謝物的量，計算回收率，從而確定最佳的乙腈-水的體積比為90:10。

2.4 線性關系及檢出限

用空白樣品提取液配制一系列不同質量濃度(10、20、50、100、200、500、1000ng/mL)的混合標準工作溶液依次進樣，以組分的峰面積(Y)對相應的質量濃度X/(ng/mL)作標準曲線，并以此作為定量依據。結果表明：r＞0.99，丙硫咪唑及其代謝物有良好的線性關系，見表2。對相同質量濃度的標準試樣在同一日內的不同時間進行10次重復實驗，目標化合物峰面積的相對標準偏差為0.75%～1.26%，說明本方法具有良好的穩定性和重復性。

表2 丙硫咪唑及其代謝物的線性方程、相關系數與檢出限Table 2 Linear equations, correlation coefficients and LODs of albendazole and its metabolites

2.5 回收率與精密度

取經測定不含丙硫咪唑及其代謝物殘留的豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、香腸樣品5.0g，分別添加0.010、0.025、0.050mg/kg含量水平，充分混合均勻，按照本方法進行液相色譜-串聯質譜測定，得到丙硫咪唑及其代謝物的回收率和相對標準偏差，結果見表3。添加0.010～0.05mg/kg時的回收率為82.3%～97.6%，相對標準偏差為4.9%～12.9%，符合國家質檢總局《殘留分析質量控制指南》的要求，可以用作肉及肉制品中丙硫咪唑及其代謝物殘留的檢測方法。

表3 樣品的回收率與精密度(n=10)Table 3 Spiked recovery rates and precision (RSD) of albendazole and its metabolites from different samples (n=10)

3 結 論

采用乙腈高速勻漿提取，高效液相色譜-串聯質譜法對肉中丙硫咪唑及其代謝物殘留的測定進行研究。該方法線性范圍寬、線性關系好、重復性好、準確度高，為肉中丙硫咪唑及其代謝物殘留的檢測建立了檢測方法和確證方法。

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[15] SN 0207—93 出口肉中丙硫咪唑殘留量檢驗方法[S].

Determination of Albendazole and Its Metabolites in Meat by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

FU Xiao-fang，WANG Peng，ZHAO Xiao-ya，LI Jing，SHANG Yin-zhu，YE Cheng
(Center of Technology, Hubei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Wuhan 430050, China)

A liquid chromatography tandem mass spectrometric (LC-MS/MS) method was established for simultaneous determination of albendazole and its metabolites including albendazole sulfone, albendazole sulfoxide and albendazole-2-aminosulfone in meat. Samples were extracted with acetonitrile and cleaned by liquid-liquid extraction. The separation of analytes was performed on an XDB-C18 column with acetonitrile and 0.1% formic acid solution as the mobile phase. The external standard calibration curve was used for quantification. The LOD of albendazole and its metabolites was 0.010 mg/kg. A good linear relationship between peak area and concentration in the range of 0.010－0.050 mg/kg for albendazole and its metabolites was achieved with a correlation coefficient of more than 0.99. The spiked recovery rates and relative standard deviations (RSDs)were 82.3%－97.6% and 4.9%－12.9%, respectively. The method was simple, fast, accurate, convenient, and applicable for qualitative and quantitative determination of albendazole and its metabolites.

albendazole；metabolites；LC-MS/MS；meat

TS255.7

A

1002-6630(2012)08-0180-04

2011-02-22

國家認監委標準修訂項目(2009B784r)

付曉芳(1980—)，女，工程師，碩士，研究方向為食品安全。E-mail：fuxf@hbciq.gov.cn