環丙沙星時間分辨熒光免疫分析方法的建立與應用

李麗華，白瑞櫻，孫遠明，沈玉棟，徐振林，雷紅濤，張 挺，王 弘，楊金易,*

(1.廣東省食品質量安全重點實驗室，華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642；

2.新鄉醫學院基礎醫學院生理學與神經生物學教研室，河南 新鄉 453003)

環丙沙星時間分辨熒光免疫分析方法的建立與應用

李麗華1，白瑞櫻2，孫遠明1，沈玉棟1，徐振林1，雷紅濤1，張 挺1，王 弘1，楊金易1,*

(1.廣東省食品質量安全重點實驗室，華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642；

2.新鄉醫學院基礎醫學院生理學與神經生物學教研室，河南 新鄉 453003)

建立基于時間分辨熒光免疫分析技術的環丙沙星(CPF)間接競爭檢測方法。將環丙沙星-卵清白蛋白(CPFOVA)包被于固相微孔板，CPF標準品或樣品中CPF與CPF包被原(CPF-OVA)共同競爭限量的CPF抗體，用銪標羊抗兔IgG示蹤，建立環丙沙星時間分辨熒光免疫分析方法(CPF-TRFIA)；考察包被質量濃度、抗體稀釋液、反應時間等對方法靈敏度的影響。結果表明：在優化條件下，該方法的檢測限為0.5μg/L，半抑制質量濃度(IC50)為4.32μg/L，線性范圍(IC20～IC80)為1.14～28.85μg/L；該方法對蜂蜜中CPF平均回收率為80.66%～100.30%，對牛奶中CPF的平均回收率為76.30%～95.22%，兩者的平均批內和批間變異系數分別為7.42%和10.92%。CPF-TRFIA間接競爭法測定環丙沙星具有靈敏度高、特異性好、性能穩定的優點，適于高通量篩查。

環丙沙星；時間分辨熒光免疫分析；抗體；添加回收

鹽酸環丙沙星(ciprofloxacin，CPF)是第3代氟喹諾酮類(fluoroquinolones，FQNs)藥物，具有抗菌譜廣、抗菌作用強、副作用小及組織分布較好等特點[1]，主要用于治療傷寒、泌尿道感染、呼吸道感染、腸道感染，廣泛應用于動物和人類的多種感染性疾病的治療。其殘留不但對人體有直接的危害，如中樞神經系統、循環系統、消化系統等的不良反應，同時動物性食品中較低濃度的環丙沙星殘留通過食物鏈向人類傳播，容易誘導人類致病菌對其耐藥性的增強，并導致周圍環境中耐藥性菌株的增加[2-3]。由于其耐藥性和潛在致癌性性，歐盟、日本及我國均對組織中環丙沙星的最高殘留限量進行了限定。

目前檢測環丙沙星的主要方法有微生物法、儀器法和免疫分析法，其中微生物法[4-6]檢測限較高、不夠靈敏，且難以準確定量[7]；儀器法主要包括液相色譜法(liquid chromatography，LC)、高效液相色譜法(high performance LC，HPLC)、高效毛細管電泳分析法(high performance capillary electrophoresis, HPCE)、液相色譜-質譜聯用法(LC mass spectrometer，LC-MS)[8-12]等。HPLC法由于測定靈敏度高、分離能力強、應用范圍廣，適用于藥物殘留的確認，是目前儀器法中應用最多的一種方法，但是其操作繁瑣、儀器昂貴、通量小限制了其進一步發展；免疫分析法(imunosorbent assay，IA)目前應用較廣泛的是酶聯免疫分析法(enzyme-linked imunosorbent assay，ELISA)[13]，但該方法存在靈敏度有限、線性范圍較窄等缺點，近年來新的免疫分析方法發展很快，例如化學發光免疫檢測、時間分辨免疫檢測等；時間分辨免疫分析法(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)采用鑭系金屬如銪(Eu3+)、鋱(Tb3+)、釤(Sm3+)、鏑(Dy3+)等作為示蹤標記物，不影響被標記物的活性，且具有靈敏度高、穩定性好等特點[14]，符合臨床診斷和科學研究的需要，其在醫學、食品分析、環境等方面具有廣闊的應用前景[15-17]，目前關于環丙沙星的時間分辨熒光免疫分析方法尚未見報道，本研究目的是建立高靈敏度的CPF-TRFIA方法，應用于環丙沙星殘留的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

牛血清白蛋白(BSA)、羊抗兔IgG 美國Sigma公司。

99.5%環丙沙星(CPF)、99.8%恩諾沙星(enrofloxacin，EN)、99.5%培氟沙星(pefloxacin，PE)、99.5%加替沙星(gatifloxacin，GA)、99.5%諾氟沙星(norfloxacin，NOR)、99.5%洛美沙星(lomefloxacin，LOM)、99.5%氧氟沙星(ofloxacin，OFL)、99.5%沙拉沙星(sarafloxacin，SAR)、99.5%那氟沙星(nadifloxacin，NA)、99.5%可林沙星(clinafloxacin，CLI)標準品 中國獸醫藥品監察所；環丙沙星-卵清白蛋白偶聯物(CPF-OVA)、環丙沙星多克隆抗體(CPF-Ab)由本實驗室提供；Eu3+-N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙酸烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)、增強液廣州市豐華生物工程有限公司；其他試劑均為國產分析純。

Wallac VITOR31420多標記分析儀 美國PE公司；超低溫高速離心機 美國Eppendorf公司；UV-3010紫外-可見分光光度計 日本Hitachi公司；超純水器 美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制和銪標羊抗兔IgG制備

試劑配制：環丙沙星標準溶液：精確稱取10.00mg環丙沙星溶于10mL超純水，配制成1mg/mL環丙沙星貯備液，使用前配成質量濃度梯度為0、1、3、9、27、81μg/L的環丙沙星標準品工作液；T液： 20mmol/L、pH7.85的Tris-HCl，含0.1% BSA、0.9% NaCl和0.05%NaN3；洗滌液： 50mmol/L、pH7.4的Tris-HCl，含0.05% Tween-20和0.04% NaN3；封閉液： 50mmol/L、pH7.4的PBS，含4%甘氨酸和0.1% BSA。

4g甘氨酸和0.1g BSA溶于100mL PBS中。

抗體制備：取溶解于50mmol/L PBS、pH7.4的10mg/mL羊抗兔IgG 0.1mL，經PD-10柱轉換緩沖鹽條件，洗脫液為50mmol/L、pH7.85 NaCO3-NaHCO3緩沖液。收集蛋白峰，經紫外吸收分析定量(1.46A280－0.74A260)，用上述洗脫液稀釋羊抗兔稀釋至5mg/mL。取200μL稀釋后的羊抗兔IgG加入含 0.5mg的Eu3+-DTTA的棕色小瓶中，置于28℃恒溫烘箱中反應48h，反應液用50mmol/L、pH7.8的Tris-HCl緩沖液平衡的Sepharose CL-6B(1cm×30cm)層析，測定每管的熒光計數值，檢測稀釋后的第一個計數峰，稀釋后備用。

1.2.2 檢測步驟

將CPF-OVA用100mmol/L NaCO3-NaHCO3溶液(pH9.6)包被液稀釋至需要濃度，96孔微孔板加100μL/孔，4℃放置過夜；棄去包被液，洗滌液洗2次，加200μL封閉液37℃封閉2h，棄去封閉液，于潔凈吸水紙上拍干；加50μL CPF參考標準液或處理好的樣品到CPF-OVA板條中，加入50μL稀釋后的CPF-Ab；25℃振蕩反應，洗滌液洗6次；加100μL稀釋過的銪標羊抗兔，25℃振蕩反應，洗滌液洗6次；加200μL增強液振蕩反應5min，讀數。

1.2.3 反應條件的優化

1.2.3.1 最佳包被質量濃度的選擇

取96孔微孔板反應條12條，用包被液將CPF-OVA作一系列稀釋，質量濃度分別為200、100、75、50μg/L，每孔3個平行，進行包被；抗體按照棋盤滴定篩選出來的質量濃度稀釋，按照檢測步驟1.2.2節方法測定各稀釋度熒光計數。以標準點(CPF質量濃度)為橫坐標、各稀釋度熒光計數(B)與最高質量濃度的熒光計數(B0)的比值為縱坐標，繪制標準曲線。曲線靈敏度較高、斜率較大的抗原質量濃度即為最適包被工作質量濃度。

1.2.3.2 最適抗體稀釋液的確定

在包被最佳質量濃度CPF-OVA板條，分別以PBS(pH7.4、100mmol/L)、PBST(pH7.4、100mmol/L)、Tris-HCl(pH7.85、50mmol/L)、T液4種溶液作為藥物稀釋液，以標準點(CPF質量濃度)為橫坐標、各稀釋度熒光計數(B)與最高質量濃度的熒光計數(B0)的比值為縱坐標，繪制標準曲線。曲線靈敏度較高、斜率較大的抗原質量濃度即為最適包被工作質量濃度。

1.2.3.3 最適競爭時間的確定

在包被好的板條中，分別加入系列質量濃度的環丙沙星標準品及抗體，分別反應15、30、45、60min，以標準點(CPF質量濃度)為橫坐標、各稀釋度熒光計數(B)與最高質量濃度的熒光計數(B0)的比值為縱坐標，繪制標準曲線。曲線靈敏度較高、斜率較大的抗原質量濃度即為最適包被工作質量濃度。

1.2.3.4 標準曲線的建立

根據優化后的條件，建立定量檢測間接競爭TRFIA方法和標準曲線，求出該方法的線性檢測范圍(IC20～IC80)和 IC50。

1.2.4 方法學考核

1.2.4.1 靈敏度

作CPF質量濃度為0的孔10個，計算10組零點標準品熒光計數的平均值(x)和標準差(s)，以零劑量點熒光值(CPS)均值x－2s后的熒光計數值在標準曲線上得到相應質量濃度為檢測限[18]。

IC50：即50%抑制率，由Origin 7.5軟件計算得出。

1.2.4.2 穩定性[19]

比較計數質量濃度0點計數的20%、50%、80%時的效應點對應的質量濃度(ED20、ED50、ED80)，根據多次測定判斷劑量反應曲線的位置漂移考核方法的穩定性。同時采用加速實驗考核長期保存的穩定性，將試劑盒于37℃孵育箱中6d后再檢測結合率、抑制率反應曲線等各項指標。

1.2.4.3 特異性

將CPF與其同系物倍比稀釋，按照1.2.2節操作，計算同系物的交叉反應率和各競爭物IC50。

1.2.4.4 回收率

牛奶樣品的處理：分別稱取1g牛奶于2mL離心管中，添加0、10、50、100ng CPF于牛奶樣品中，靜置10min，10000r/min離心10min。用純水稀釋20倍后直接用于檢測。

蜂蜜樣品的處理：分別稱取2g蜂蜜于15mL離心管中，分別添加0、20、100、200ng CPF于蜂蜜樣品中，靜置10min，加4mL超純水、4mL乙酸乙酯，旋渦振蕩20min，4000r/min離心10min。取上清液，用氮氣吹干。加入4mL水和4mL正己烷，充分振蕩后，4000r/min離心5min，棄去上層，取50μL下層清液待測。

2 結果與分析

2.1 Eu3+-羊抗兔抗體的理化和免疫學鑒定

Eu3+-標記物經Sepharose CL-6B層析，結果如圖1所示，收集第一個(8、9、10管)洗脫峰。以PE-Wallac提供的Eu3+-羊抗兔抗體第一洗脫峰的Eu3+含量為95.3μmol/L，蛋白含量為10.9μmol/L，即平均每個羊抗兔抗體分子分別連接了8.74個銪。

圖1 Eu3+-羊抗兔熒光和紫外檢測圖Fig.1 UV and fluorescence spectra of Eu3+-goat anti-rabbit IgG

2.2 最佳包被質量濃度的確定

圖2 不同包被質量濃度的TRFIA抑制曲線Fig.2 Indirect competitive CPF-TRFIA curves under various coating concentrations

不同包被質量濃度得到的TRFIA抑制曲線如圖2所示。包被質量濃度為100μg/L時曲線斜率較大，IC50值最低，靈敏度最高，且其零質量濃度點熒光值范圍合理。因此選擇包被質量濃度為100μg/L。

2.3 最佳競爭時間的確定

不同一抗反應時間所得到的TRFIA抑制曲線如圖3所示，反應時間在15min以上后熒光值趨于穩定，說明反應充分，且此時IC50值最低、靈敏度最高，且其零質量濃度點熒光值范圍合理。故選擇反應時間為15min。

圖3 不同反應時間的TRFIA抑制曲線Fig.3 Indirect competitive CPF-TRFIA curves under various reaction times

2.4 最佳抗體稀釋液的選擇

在最佳包被條件和最佳反應時間條件下，不同抗體稀釋液得到的TRFIA抑制曲線如圖4所示，T液作為抗體稀釋液時曲線斜率較大，零點較高，IC50值最低，靈敏度最高，且其熒光值范圍合理。因此選擇抗體稀釋液是T液。

圖4 不同抗體稀釋液的抑制曲線Fig.4 Indirect competitive CPF-TRFIA curves using various antibody dilutions

2.5 標準曲線的建立

圖5 環丙沙星標準曲線的建立Fig.5 Standard curve of indirect competitive CPF-TRFIA for ciprofloxacin

實驗過程中發現，標準品的質量濃度調整為0、1、3、9、27、81μg/L，曲線的線性良好，采用以上優化好的包被質量濃度、反應時間、抗體稀釋液等，在最佳條件下，間接競爭CPF-TRFIA的結果經Origin 7.5軟件的Log-Logit函數處理所得標準曲線，如圖5所示，該方法的線性范圍(IC20～IC80)為1.14～28.85μg/L，IC50值為4.32μg/L。

2.6 CPF- TRFIA方法的考核

2.6.1 方法的靈敏度和穩定性

以零劑量點發光之均值減去2s后的發光值在標準曲線上得到響應值為檢測的靈敏度，間接競爭CPF-TRFIA的靈敏度為0.5μg/L。8條不同時間進行的間接競爭CPFTRFIA的效應點均值ED80、ED50、ED20分別為(1.13±0.10)、(4.32 ±0.31)、(28.85 ±0.39)μg/L。說明劑量反應曲線的位置漂移小，方法的穩定性好。同批量連續6個月應用分析，發現劑量反應曲線基本一致；試劑盒置于37℃孵育箱中6d后其0質量濃度點的計數為4℃同時保存試劑的90%、取代比(B0/B100)在10左右，劑量反應曲線與4℃保存的試劑結果相似。由于在加速實驗中以1d代替1個月，所以其有效期應在6個月以上。

2.6.2 方法的特異性

采用間接競爭CPF-TRFIA檢測，將CPF標準品與其他喹諾酮類(FQNs)藥物均先稀釋至1mg/mL，然后用水作梯度稀釋，用CPF-Ab做間接競爭TRFIA，結果見表1。由于氟喹諾酮類藥物含有共同的喹諾酮萘啶環，之間存在一定的交叉反應，與恩諾沙星、培氟沙星、加替沙星、諾氟沙星之間的交叉反應率分別為11.09%、13.43%、11.67%、11.04%(表1)。

表1 與其他喹諾酮類的交叉反應性Table 1 Cross reactivity with other FQNs

2.6.3 方法的回收率

間接CPF-TRFIA在環丙沙星添加量為10、50、100ng/g 之間的批間和批內變異分別為7.42%和10.92%，其應用于牛奶和蜂蜜中的添加回收率如表2所示。

表2 間接CPF-TRFIA測定樣品中CPF的回收率(n＝5)Table 2 Recovery rates of ciprofloxacin from samples determined by indirect competitive CPF-TRFIA (n＝5)

3 討 論

隨著環丙沙星在動物性食品中的廣泛應用，其殘留問題已引起廣泛的關注。環丙沙星殘留易造成人和動物的過敏反應且具有潛在“三致”作用，并會導致細菌殘生抗藥性[20]。其在動物性食品中的殘留及耐藥性問題已引起重視。歐盟規定：FQs在動物雞肉、肝臟和腎臟中最大藥物殘留為30μg/kg(恩諾沙星和環丙沙星量之和)[9]。我國農業部獸藥殘留指定動物性食品中最高殘留量為100～300μg/kg(恩諾沙星和環丙沙星量之和)[22]。日本規定對進口鰻魚中的環丙沙星和恩諾沙星類的檢測限為 50μg/kg[23]。

高靈敏、大通量、快速檢測方法對于預防污染和中毒，并對動物性食品進行檢測是最有效的手段，因此開展CPF等獸藥檢測方法的研究和應用非常重要。GB/T 21312—2007《動物源性食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測方法：液相色譜-質譜/質譜法》中用液相色譜-質譜法對動物組織中環丙沙星的定量限為8ng/g[24]；Guo等[9]利用熒光檢測器檢測環丙沙星在鰻魚中的代謝規律。但這些方法需要的儀器昂貴、難攜帶等，難以應用于大規模的現場檢測。在免疫分析方面較常用的是酶聯免疫分析法，Hu等[25]建立了檢測魚肉中恩諾沙星和環丙沙星殘留的ELISA方法，該方法的IC50為245.86μg/L，在魚肉中的添加回收率在80.57%～94.61%之間，相對于TRFIA方法仍然存在靈敏度不夠高，線性范圍不夠寬等缺點。本研究建立的間接競爭CPF-TRFIA，經過條件優化，該方法的檢測限為0.5μg/L，IC50為4.32μg/L，線性范圍(IC20～IC80)為1.14～28.85μg/L。方法對蜂蜜中CPF平均回收率在80.66%～100.30%之間，對牛奶中CPF的平均回收率在76.30%～95.22%之間。批間和批內變異分別為7.42%和10.92%。本方法可滿足實際樣品的檢測要求，并滿足其線性范圍相對較寬的要求，樣品處理簡單，可實現全自動大批量樣品篩查，有推廣應用前景。

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Development and Application of Time-resolved Fluroimmunoassay (TR-FIA) for Ciprofloxacin Determination

LI Li-hua1，BAI Rui-ying2，SUN Yuan-ming1，SHEN Yu-dong1，XU Zhen-lin1，LEI Hong-tao1，ZHANG Ting1，WANG Hong1，YANG Jin-yi1,*
(1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Food Quality and Safety, College of Food Science, South China Agricultural University,Guangzhou 510642, China；2. Department of Physiology and Neurobiology, School of Basic Medical Sciences,Xinxiang Medical University, Xinxiang 453000, China)

A time-resolved fluroimmunoassay (TRFIA) for the determination of ciprofloxacin (CPF) in an indirect competitive immunoassay mode was developed and applied. CPF-OVA was coated by physical adsorption onto a microtitre plate, and CPF standard or sample was competed with CPF-OVA for limited anti-CPF antibody, which was traced using europium-labeled goat anti rabbit IgG. The effects of experimental conditions including CPF-OVA concentration, buffer type, and reaction time on the sensitivity of TRFIA were explored. Under optimal conditions, the method revealed a detection limit of 0.5 μg/L, an IC50 of 4.32μ g/L and a linear range (IC20－IC80) of 1.13－28.85 μg/L. The spike recovery rates of CPF in honey and milk at three spike levels were in the range of 80.66%－100.30% and 76.30%－95.22%, respectively, and the intra-batch and inter-batch coefficients of variation were 7.42% and 10.92%, respectively. The method was sensitive, specific, stable and suitable to be used for high-throughput determination of CPF residues.

ciprofloxacin；time-resolved fluroimmunoassay；antibody；recovery

S859；O625.6

A

1002-6630(2012)08-0216-05

2011-03-24

廣東省科技廳2010粵港招標項目(2010A020104004)；廣東省-教育部產學研結合項目(2010A090200084；2009B090300409)；國家公益性行業(農業)科研專項(201003008-08)；廣東省科技計劃項目(農業攻關2009A020101004)

李麗華(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為食品安全快速檢測。E-mail：lihua361@126.com

*通信作者：楊金易(1979—)，男，助理研究員，博士后，研究方向為食品安全。E-mail：yjy361@163.com