小鵝瘟研究進展

甘軍紀 魏平華（ 揚州大學獸醫學院 江蘇揚州 5009 廣州格雷特生物科技有限公司 廣州 50730）

小鵝瘟 (Gosling plague,GP)是由鵝細小病毒(Goose Parvovirus,GPV)引起雛鵝和雛番鴨的一種高度接觸性和致死性疾病,是目前危害水禽業健康發展的最嚴重的傳染病之一，可造成嚴重的經濟損失。小鵝瘟由方定一教授于1956年在揚州市首先發現，1961年從病死雛鵝體中分離到病毒,并對病毒的各種特性及特異性防治制劑進行深入系統的研究[1-4]。1966年匈牙利學者德金氏(Derzsy′s)用鵝胚首次分離到病毒，1974年，世界家禽協會將該病定名為Derzsy′s 病[4-5]。

1 病原

小鵝瘟病毒屬于細小病毒科、細小病毒屬成員，病毒顆粒直徑20～22nm（圖1）[6]，不能凝集禽類、哺乳動物和人類的紅細胞[4,7]。病毒對外界因素的抵抗力很強,能抵抗乙醚、氯仿、胰酶、pH 3和56℃3h作用處理。抗原分析表明，國內外所有GPV分離株屬于同一個血清型[4,5,8]。GPV可在鵝胚、鴨胚及其細胞上適應和培養。

圖1 GPV電子顯微鏡照片（標尺:100 n m）[6]

GPV實驗室感染雛鵝或雛番鴨后，病毒在體內呈廣泛分布，尤其在肝、脾、哈德斯腺、胸腺和法氏囊中病毒含量較高[9,10]。因此，病鵝的心血、肝臟、脾臟、腦及腸管和腸內容物均可用于病毒分離。病料用生理鹽水或 PBS 研磨制成 1∶5～1∶10 懸液，3000r/min離心10min，每1mL上清加入青霉素、鏈霉素各1000IU，37℃孵育30min，接種12～14日齡鵝胚絨毛尿囊膜（CAM）或尿囊腔，接種后3～7天，鵝胚死亡。死亡鵝胚病變表現為:CAM增厚并有灰白色壞死點，鵝胚全身充血，翅尖、趾、頸部和喙旁有嚴重的出血點。肝臟充血及邊緣出血，心肌、后腦出血，頭部、頸部及兩肋皮下均有水腫[4,11]。

2 流行病學

小鵝瘟主要發生于3～30日齡雛鵝。雛鵝通常3～5日齡發病，2～3天迅速蔓延至全群，在7～10日齡發病率和死亡率達到高峰，死亡率50%以上，以后逐漸下降。年齡越小，死亡率越高，可達100%。年齡大的病鵝，其癥狀較輕，病程較長[4,12]。20世紀80年代后，45～55日齡的鵝有發生典型的小鵝瘟而大量死亡的病例[8]。90年代發現雛番鴨感染GPV病例,發病率50%～70%，病死率達40%～65%[11]。病雛鵝和帶毒成年鵝是本病的傳染源，在自然情況下主要通過消化道感染。健康雛鵝通過與病鵝、帶毒鵝的直接接觸或采食被病鵝、帶毒鵝排泄物污染的飼料、飲水及接觸被污染的用具和環境（如鵝舍、炕坊等）都可以引起本病的傳播[4]。

3 臨床癥狀

本病的潛伏期為3～5天。3～5日齡病鵝，通常表現最急性的敗血癥狀，病程只有1天左右,病鵝表現精神委頓、絕食等癥狀后即告死亡,死亡率可達100%。6～15日齡發病鵝，通常表現為急性型，表現步態不穩，或伏地不肯起立；呼吸困難，鼻孔流漿液性分泌物；腹瀉，泄出物呈灰白色或淡黃綠色米泔水狀并混有氣泡，肛門突出，被毛潮濕并沾有污物；1～2天死亡，瀕死前頭頸伏地、兩肢麻痹，或瀕死前扭頸抽搐，或是出現勾頭、仰頭、角弓反張等神經癥狀。15日齡以上發病鵝，通常表現為亞急性型，以精神委頓、縮頭垂翅、消瘦和拉稀為主，病程為3～7天或更長，少數幸存者能自行康復，但在一段時期內生長不良[2,4]。

4 病理變化

本病的特征性病變是小腸（空腸、回腸）發生急性卡他性-纖維素性壞死性腸炎。腸管外觀極度膨大，質地堅實，長約2～15cm，狀如香腸[4]。剖開后可見灰色或淡黃色的栓子將腸管全部塞滿。切開栓子，中心為深褐色干燥的腸內容物，外面包有纖維素性滲出物和壞死物凝固形成的外衣（圖2）。有些病例在小腸內形成帶狀，似絳蟲樣纖維素性凝固物。小腸黏膜與假膜脫落后，仍保持其光滑的表面，無潰瘍，腸壁菲薄，結構完全破壞。腸壁平滑肌纖維發生實質變性和空泡變性以致蠟樣壞死。直腸黏膜腫脹充血，有明顯的出血點或出血斑。心肌蒼白，心包積液；肝腫脹呈黃色，膽囊腫脹，充滿稀黃膽液[4,12-13]。

圖2 小腸內形成的栓子將腸管塞滿

5 診斷

根據流行病學特征、臨診癥狀和剖檢病變，小鵝瘟一般不難作出診斷，但GP的發生特點已變得不典型，GP過去一般多發生于3周齡以下的雛鵝，現在其發病年齡有增大的趨勢，出現非典型或潛伏感染現象，常規診斷方法難以確診。GP的確診需借助實驗室檢查，用于本病實驗室診斷的方法有:病毒分離、瓊脂擴散試驗、ELISA、免疫熒光、中和試驗、免疫電鏡、核酸探針和PCR等[9,13-15]。實驗室診斷方法中，單抗介導的間接免疫熒光試驗是檢測該病病原特異、簡便和快速的診斷方法,能在2h內確診[7]。Zhang等（2010）利用重組VP3蛋白建立了VP3-ELISA，可以快速、特異檢測鵝GPV或番鴨MDPV感染抗體及監測疫苗免疫抗體[16]。環介導等溫擴增技術（LAMP）是一種簡單、快速(1～2h)、特異性強和耗費低的核酸擴增技術，可以在等溫條件下一步完成。Yang等(2010)成功建立可檢測臨床GPV感染的LAMP方法,該方法的檢測靈敏度達到28拷貝/μL[17]，具有較好的應用前景。

近年來，水禽疫病呈上升趨勢，鵝的病毒性疾病除了小鵝瘟以外,又相繼出現了雛鵝新型病毒性腸炎、鵝副黏病毒病、鵝禽流感和鵝的鴨瘟等病，在臨床病例中既有單一感染,也有混合感染,需進行鑒別診斷。鮮思美等（2009）建立了檢測DPV（鴨瘟病毒）、GPV（小鵝瘟病毒）、MDPV（番鴨細小病毒）和GPMV（鵝副黏病毒）等的基因芯片檢測方法，該方法對DPV、GPV、MDPV和GPMV的檢測具有同步檢測和鑒別診斷的功能[18]。

6 病毒的分子生物學

GPV分子生物學研究是新型疫苗研制和新診斷方法建立的基礎，近年來在此領域已取得重大進展。

6.1 基因組結構 GPV病毒基因組DNA為單鏈、線性DNA,大小約5.0kb。GPV基因組中間為編碼區，兩端為回文序列折疊形成發夾結構，即倒置末端重復序列 (ITR)。中間編碼區含有兩個開放閱讀框架(ORF)，但兩個ORF位于同一個讀碼框，左ORF(LORF)編碼NS1、NS2兩種非結構蛋白，右側ORF(RORF)編碼 3 種結構蛋白(VP)，即 VP1、VP2 和 VP3，其中VP3是主要衣殼蛋白，約占總蛋白的80%[5,18-19]。萬春和等（2011）采用PCR技術擴增獲得1株鵝細小病毒株（GoPV）全基因序列(HQ891825)，該病毒全基因大小為5106 nt。GoPV株病毒全基因與歐洲疫苗株 VG32/1（EU583392）相似性最高，高達 98.6%；與匈牙利鵝細小病毒分離株Virulent B(U25479)相似性最低，為 93.6%[20]。GPV 全基因結構見圖 3。

圖3 GPV基因組結構

6.2 基因組開放閱讀框及編碼區的排布 GPV正鏈上有2個相距18nt開放閱讀框 (ORF)，基因組左側ORF編碼非結構蛋白。存在2個可能起始密碼子，第一個起始密碼子ATG位于537nt處，起始大的非結構多肽NS1，第二個ATG位于1065nt處，起始第二個非結構多肽NS2，NS1和NS2共同終止于2420nt處[20]。GPV3個結構蛋白由位于基因組右側ORF編碼，位于 2439nt和3033nt處2個起始密碼子（ATG）分別起始VP1和VP3轉譯。推測VP2是由位于2874nt處不典型的起始密碼子ACG起始，這與MDPV、AAV-2的VP2相一致。3個結構蛋白均終止于4637nt處的同1個TAA終止密碼子,在其右側的ITR 前有 1 個 Poly（A）尾[18]。

6.3 倒置末端重復序列（ITR)GPV基因組的兩側各含有長444個核苷酸的倒置末端重復 (ITR)[18,20]。ITR的3’，5’末端的407個核苷酸可折疊形成U形雙鏈發夾結構，發夾結構中含有181個無錯配“莖”部和44個堿基的“泡”區，形成了1個形似“箭”狀的結構，在箭頭上有1個SphⅠ限制性內切酶的酶切位點（GCATGC）。在報道的鵝細小病毒基因中，ITR序列的長短有所不同（381～444nt）[21]。

6.4 病毒基因組編碼的結構蛋白 GPV基因組編碼3種結構蛋白，即VP1、VP2和VP3。已報道3種蛋白質分子大小與由ORF推測的分子量略有不同，分別為 81.3～88 ku、60～72 ku 和 55～60 ku[16,21-22]。VP1、VP2和VP3蛋白多肽分別由732、587和534個氨基酸殘基組成[12]。桿狀病毒表達的GPV結構蛋白在昆蟲細胞中能夠自組裝成病毒樣顆粒[23]。VP3是GPV主要免疫保護性抗原，能誘導機體產生具有中和作用的抗體，是用于構建GPV基因疫苗的理想基因[24-25]。

7 疫苗研究

目前獲得注冊并取得生產文號的小鵝瘟疫苗主要有3種:小鵝瘟活疫苗（SYG26-35株，種鵝用）、小鵝瘟活疫苗（SYG41-50株，雛鵝用）和小鵝瘟活疫苗（GD株，種鵝用）。

7.1 小鵝瘟活疫苗（SYG26-35株） 1961年分離到小鵝瘟病毒（SYG61株）,SYG61株病毒連續通過易感鵝胚傳代14代后對成年鵝無致病力[3-4]。繼續在鵝胚上傳代至26～35代（SYG26-35）的毒種接種12日齡易感鵝胚用于制造種鵝用疫苗，免疫種鵝的后代雛鵝在3個月內能抵抗小鵝瘟強毒的感染，保護率95%以上。1996年小鵝瘟活疫苗（SYG）獲得新獸藥證書。

7.2 小鵝瘟活疫苗（GD株） 陳伯倫等（1985）用廣東省小鵝瘟強毒株(GB)在鴨胚上連續傳代育成1株小鵝瘟鴨胚化GD弱毒株，用GD20-28代毒種接種8日齡鴨胚制備種鵝用疫苗。母鵝在產蛋前1個月注射疫苗后至母鵝270天（日齡）所產的蛋孵出的雛鵝,用強毒攻擊,其保護率達100%,270～312天內出殼雛鵝,其保護率只達 82.8%～88.8%[8]。小鵝瘟活疫苗（GD株）已獲得新獸藥注冊。

7.3 小鵝瘟活疫苗（SYG41-50株） SYG61株病毒連續通過鵝胚20代之后對雛鵝無致病力[4]，繼續在鵝胚上傳代至41～50代（SYG41-50）的毒種接種12日齡易感鵝胚用于制造雛鵝用小鵝瘟疫苗。該疫苗適用于種鵝未經免疫的后代雛鵝,或種鵝免疫時間較長的后代雛鵝作免疫預防。雛鵝出殼48小時內皮下注射適當稀釋的疫苗0.1mL（1羽份）。使用疫苗時間愈早愈好，免疫雛鵝1個月內的保護率可達90%以上[1]。

在常規疫苗研究方面，其他研究者也進行了一系列實驗室研究。江美娟等（1984）將小鵝瘟病毒（SYG61）鵝胚繼代25代的毒株（YG25），再在鴨胚上連續繼代18代，獲得鴨胚化小鵝瘟弱毒株，其對1日齡的雛鵝無任何不良反應，皮下注射免疫效果顯著[26]。陳少鶯等（2002）用發病的雛番鴨分離的鵝細小病毒莆田株(GPV-PT株，病毒對1日齡雛番鴨的發病率為100%,死亡率為80%)，在番鴨胚成纖維細胞(MDEFC)連續傳代25代，獲得鵝細小病毒弱毒疫苗株，用于1日齡雛番鴨免疫，7天后強毒攻擊,獲得100%保護[27]。程安春等（2005）將 GPV-CHv強毒株通過鵝胚5代，再經10日齡鴨胚連續傳代15代,獲得GPV鴨胚化弱毒GPV-Cha15株，GPV-CHa15株用0.5 mL的劑量經口服、皮下注射、肌肉注射、滴鼻和靜脈注射途徑免疫1日齡鵝后無任何不良反應；GPV-CHa15株免疫雛鵝后第3天即可產生較為堅強的免疫保護。母鵝免疫后第15天的后代雛鵝可100%抵抗強毒攻擊[11]。

7.4 新型疫苗研究

7.4.1 亞單位疫苗 Ju等（2011）利用桿狀病毒表達系統在昆蟲細胞中分別表達GPV結構蛋白VP1、VP2和VP3，它們能夠自組裝成病毒樣顆粒（VLPs），VLPs無感染性，但具有良好免疫原性，可作為重組亞單位疫苗[22-23]。GPV VLPs加入50%礦物油佐劑免疫4日齡雛鵝能產生高滴度的中和抗體，抗體滴度高于滅活疫苗和活疫苗[22]。Lee等（2010）利用桿狀病毒表達系統在昆蟲細胞中分別表達GPV結構蛋白VP2，0.3%二乙烯亞胺（BEI）滅活，以氫氧化鋁或 CpG ODNs為佐劑，免疫9日齡鴨，首次免疫后14天進行二次免疫，產生良好抗體應答[28]。

7.4.2 基因工程疫苗 朱德康等（2011）比較小鵝瘟病毒（GPV）VP3基因疫苗（pcDNA-GPV-VP3）和弱毒疫苗免疫鵝的免疫應答，結果表明，pcDNA-GPVVP3免疫雛鵝后能在免疫部位皮膚、心肌和各腸段中表達并能夠誘導鵝體產生良好的細胞免疫和體液免疫，基因疫苗免疫鵝血清抗體從第14天開始升高，第28天達最大值，第217天仍然顯著高于對照組，基因疫苗誘導鵝體產生免疫應答的能力與弱毒疫苗相當[24]。于志丹等（2008）將GPV-VP3基因和GPMVF基因插入到禽痘病毒基因組的復制非必需區,成功構建了重組雞痘病毒rFPV-VP3-F[25]，但其在鵝上的免疫效率試驗還未見報道。

8 預防與治療

8.1 種鵝免疫 根據小鵝瘟的流行規律,免疫種鵝使其后代雛鵝從母鵝體獲得天然被動免疫力(即母源抗體)是主要的途徑，即在產蛋前15～30天,以小鵝瘟活疫苗給種鵝行肌肉注射(1羽份，1mL/只)。從注射疫苗后12～100天,母鵝所產的種蛋孵出的雛鵝,均可獲得抵抗小鵝瘟病毒的堅強抵抗力[1,3]。種鵝在產蛋前30天內進行2次活疫苗免疫（間隔2周），雛鵝的保護期可延長至免疫后5個月。

8.2 雛鵝免疫 來源于非免疫種鵝群或免疫后期種群孵化的雛鵝，在出殼后48h內，應用小鵝瘟活疫苗（SYG41-50株）進行免疫，免疫后7天內嚴格隔離飼養，防止強毒感染。已感染發病的雛鵝進行免疫注射無明顯預防效果[1]。

需要注意的是小鵝瘟主要通過污染孵坊傳播，因此孵坊中的一切用具和設備在每次使用后，必須清洗消毒。種蛋入孵前需清除表面污染物，用福爾馬林熏蒸消毒，盡量不要從疫區引進種蛋和雛鵝。

8.3 治療 抗小鵝瘟血清或精制高免卵黃抗體用于疫區初生雛鵝緊急預防和患病雛鵝早期治療,效果極佳。抗血清或卵黃抗體的瓊擴效價應在1∶8以上[1]。在小鵝瘟威脅地區，出殼后24h內的雛鵝,每只皮下注射0.3～0.5mL，其保護率達95%以上；緊急預防時，0.5～0.8mL/只皮下注射，保護率達 90%左右；對已發病雛鵝，1mL/只皮下注射，治愈率有 40%～50%[4]；1 月齡以上的病鵝，注射2mL/只，能夠控制和撲滅本病的流行。另外可在日糧中加一些抗菌藥（環丙沙星、強力霉素等）以防止繼發感染，在飲水中加5%葡萄糖及0.05%維生素C增強其抵抗力[29]。

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